Anvendelse af polyethyleniminpolymer i cellekultur som tilknytningsfaktor og lipofektionsforstærker

PEI fremmer tilknytningen af svagt forankrende celler og primære væv

PC-12-celler anvendes som en model for neuronal differentiering i laboratoriet, da behandling af disse celler med nervevækstfaktor (NGF) inducerer neuritudvidelse og ekspression af biokemiske markører for den sympatiske neuronale fænotype . De vokser som svagt forankrende celler, og der anvendes ofte kollagen- eller polylysinpolymerer til forbelægning af plader til PC-12 cellekultur . PC-12-celler blev dyrket i laboratoriet i naive brønde eller i brønde, der var præ-belagt med forskellige fastgørelsesfaktorer (multiwell-12 vævskulturskåle), for at observere virkningen på cellernes forankring til substratet. Uden belægningsmiddel viste cellerne en karakteristisk tendens til at danne klynger af celler, der samler sig mod midten af brønden; disse celler er fast knyttet indbyrdes, men meget svagt knyttet til vævskulturskålen (figur 1D). Dette resulterer i en meget heterogen fordeling af cellerne (der er meget få celler tilbage i kanten af brøndene) og et betydeligt tab af celler under vaskeprocedurer eller ved skift af medium. Forbehandling af pladerne med PEI resulterede i en betydeligt mere homogen fordeling af cellerne i brønden, hvor cellerne hæfter fast til pladen og viser en meget mindre tendens til klyngedannelse (figur 1A). Til sammenligning blev pladerne også forbehandlet med andre almindeligt anvendte belægningsmidler, kollagen (figur 1B) og poly-D-Lysin (PDL; figur 1C), hvilket også resulterede i fastere fastgørelse af cellerne til pladerne og en mere homogen fordeling af cellerne.

For yderligere at teste den forankringsforbedrende egenskab, der er observeret med PEI-forbehandling af kulturskålene, blev der anvendt et andet system. Retinale explanter fra teleostfisk er blevet anvendt til undersøgelse af nervegenerering . Når fiskenes synsnerve påføres en læsion, indledes en regenerationsreaktion, og nethindens ganglieceller (RGC’er) forlænger igen deres axon mod det tektale målvæv. Hvis nethinden fra en sådan “primed” fisk udtages og dyrkes, observeres regenerationsreaktionen in vitro ved en fremskyndet forlængelse af lange neuritter. Dette fænomen kræver imidlertid, at der anvendes ekstracellulær matrix eller tilknytningsfaktorer (f.eks. kollagen eller PDL-belægning), da eksploranterne har meget lav affinitet for den ubelagte plastoverflade. Der blev gennemført forsøg for at undersøge, om PEI kunne fungere som en fastgørelsesfaktor, der fremmer axonal udvækst fra zebrafiske nethindeseksplantationer. Retinaleksplorater fra kontrolzebrafiskeøjne var i stand til at sætte sig fast på PEI-forbehandlede kulturskåle (figur 1E). Desuden kunne nethindeeksplantationer fra fisk, der havde fået en konditioneringslæsion, udvide axoner kraftigt, når de blev dyrket med PEI som tilhæftningsfaktor (figur 1F).

Resultaterne med nethindeeksplantationer tyder på, at neuronale celler, der er fastgjort til PEI-belagte tallerkener, kan differentiere og generere neuritter, der hæfter godt til substratet. For at teste denne hypotese med de pro-neuronale PC-12-celler blev der udført differentieringsforsøg ved NGF-behandling med celler, der var fastgjort til tallerkener belagt med PEI. De PC-12-celler, der blev behandlet med NGF, forblev fast knyttet til pladen i flere dage og dannede netværk af neuritter (figur 2). Resultaterne tyder på, at PEI er gunstigt for differentieringsprocessen og for fasthæftningen af neuritterne til fadet. De differentierede celler forblev fast forankret under alle immunocytokemiske eksperimenter (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García og R. P. Ballestero, upublicerede resultater).

Styrke af forankring af eukaryote celler til kulturskåle, der er forbehandlet med PEI og andre fastgørelsesfaktorer

Tre forskellige cellelinjer blev udvalgt for at teste PEI’s evne til at fremme en stærk forankring til plastikkulturskåle. PC-12- og HEK-293-celler er ovenfor beskrevet som svagt forankrende. På den anden side er MYS-cellerne primære fibroblaster, der klæber stærkt til plastikkulturskåle og vokser til et monolag af celler på overfladen. For at teste styrken af de forskellige cellers forankring til pladerne blev der udført en protokol, hvor der blev foretaget 4 på hinanden følgende vaske med isotonisk buffer, efterfulgt af en kolorimetrisk protokol til tælling af de celler, der forblev i pladen (baseret på det vitale farvestof neutralrødt). Plader, der var forbehandlet med de forskellige vedhæftningsfaktorer, blev sammenlignet med plader, der ikke blev forbehandlet (ubehandlet). Eksperimenterne blev udført i tre eksemplarer, og gennemsnittet af det farvestof, der blev tilbageholdt i de plader, der fik hver behandling, blev beregnet. Disse gennemsnit blev normaliseret til det gennemsnit, der blev opnået med PEI-forbehandlingen, som fik den arbitrære værdi 100,0 % i alle eksperimenterne. Resultaterne fra repræsentative forsøg med de 3 cellelinjer er vist i figur 3 (der blev udført mindst tre uafhængige forsøg med hver cellelinje). PC-12-cellerne hæftede næsten lige godt på plader belagt med PEI, kollagen eller PDL (relative celletal på 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % og 96,3 % ± 5,8 % for henholdsvis PEI, kollagen og PDL). Der blev imidlertid observeret et betydeligt tab af celler ved sammenligning af ubehandlede plader med PEI-forbehandlede plader med et relativt celletal på 43,9 % ± 5,8 % (Figur 3A). I tilfælde af HEK-293 hæftede cellerne sig stærkt til både PEI- og PDL-forbehandlede brønde. I det repræsentative forsøg, der er vist i figur 3B, var det relative antal med disse to behandlinger henholdsvis 100,0 % ± 0,4 % og 96,8 % ± 1,7 %. Der gik imidlertid et stort antal celler tabt, når de blev udplottet i de ubehandlede brønde (relativt antal på 8,3 % ± 0,6 %) eller i de brønde, der var forbehandlet med kollagen (11,5 % ± 1,2 %), hvilket tyder på, at disse celler hæfter ret løst på plast eller på kollagenbelagte brønde. Endelig, når fibroblastcellerne (MYS-celler) blev anvendt, syntes cellerne at hæfte ret godt på alle fire overflader, herunder på de ubehandlede brønde (figur 3C). Figur 3C viser et repræsentativt plot med et relativt antal MYS-celler på 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % og 77,1 % ± 1,4 % med brønde, der var forbehandlet med henholdsvis PEI, kollagen eller PDL, eller ubehandlede brønde. Denne cellelinje hæfter derfor forholdsvis godt til den ubehandlede plastoverflade sammenlignet med PC-12- og HEK-293-cellelinjerne.

For at give en indikation af variationen mellem eksperimenterne blev gennemsnittene ± standardafvigelserne af de relative celletællinger, der blev opnået i de uafhængige eksperimenter, beregnet for hver cellelinje og behandling (bemærk, at da tællingen for PEI-forbehandlede brønde i alle eksperimenter blev sat til 100,0 %, er værdien for det globale gennemsnit med dette overfladebehandlingsmiddel præcis 100,0 % for alle cellelinjer). De sammenlignende resultater for de andre behandlinger er angivet nedenfor. For PC-12-cellerne var de relative tællinger 81,5 % ± 8,8 % for kollagenpræterede brønde (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % for PDL-præterede brønde (n = 4) og 52,1 % ± 13,7 % for ubehandlede brønde (n = 4). For HEK-293-cellerne var det relative antal 16,3 % ± 12,7 % for kollagenforpræterede brønde (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % for PDL-forpræterede brønde (n = 3) og 9,0 % ± 4,1 % for ubehandlede brønde (n = 3). I forsøgene med MYS-celler var gennemsnittet af de relative tællinger med kollagenpræterede brønde 92,7 % ± 16,2 % (n = 3), 71,1 % ± 6,7 % for PDL-præterede brønde (n = 3) og 78,4 % ± 11,5 % for ubehandlede brønde (n = 3). Statistisk analyse viser, at forbedringen af adhæsionen af både PC-12- og HEK-293-celler til PEI-forbehandlede fade i forhold til ubehandlet plast er signifikant (henholdsvis p < 0,05 og p < 0,01, t-test-analyse), mens den ikke er statistisk signifikant for MYS-celler (p > 0,05).

For yderligere at karakterisere egenskaberne af PEI som en fastgørelsesfaktor for svagt forankrende celler blev der udført forsøg for at analysere den dosis PEI, der kan give optimal celleforankring, det område af cellenumre, der kan drage fordel af tilstedeværelsen af PEI, og stabiliteten af PEI som fastgørelsesfaktor. Figur 4A viser resultaterne fra et repræsentativt forsøg, hvor HEK-293-cellerne blev testet med hensyn til styrken af HEK-293-cellernes vedhæftning til tallerkener belagt med forskellige doser af PEI. Celtallene blev normaliseret til den værdi, der blev opnået for behandlingen med 25 μg/ml PEI, som blev sat til 100,0 %. Resultaterne viser, at koncentrationer af PEI på 2,5 μg/ml eller derover resulterede i maksimal forbedring af vedhæftningen, hvilket tyder på, at overfladen af plastskålen er fuldt belagt med polymeren ved disse koncentrationer. De højere koncentrationer af polymeren syntes ikke at have toksiske virkninger på cellerne, hvis det overskydende PEI, der var tilbage i opløsningen, blev fjernet grundigt (der blev observeret mindre toksiske virkninger ved koncentrationen 250 μg/ml, hvis opløsningen ikke blev fjernet fuldstændigt efter behandlingen). Det viste eksperiment er repræsentativt for 4 uafhængige eksperimenter. Figur 4B viser de resultater, der er opnået med forskellige antal PC-12- og HEK-293-celler. Figuren viser relative celletællinger, hvor en vilkårlig værdi på 100,0 % blev tildelt den gennemsnitlige tælling, der blev opnået fra de PEI-behandlede brønde med det højeste antal af hver cellelinje (3,2 × 105 HEK-293-celler og 1,5 × 106 PC-12-celler). Resultaterne viser, at PEI fungerede godt som en fastgørelsesfaktor over et bredt spektrum af celletal for både PC-12- og HEK-293-celler. Lavere celletal kunne ikke testes pålideligt, fordi de lå tæt på følsomhedsgrænsen for den neutrale røde test. De viste resultater er repræsentative for mindst 4 uafhængige eksperimenter udført med hver cellelinje. Figur 4C viser resultaterne af et forsøg, der blev udført for at teste stabiliteten af PEI som en vedhæftningsfaktor. I dette forsøg blev et sæt plader behandlet med PEI og derefter opbevaret i PBS ved 4 °C i 10 dage. I et andet forsøg blev pladerne behandlet med PEI og opbevaret (med medium) i et CO2-inkuberingsapparat ved 37 °C i 3 dage, idet der blev skiftet medium hver 24. time. PEI’s ydeevne i disse plader blev derefter sammenlignet med plader behandlet med PEI ved hjælp af den standardprotokol, der er beskrevet for tidligere eksperimenter. Resultaterne viser det relative celletal normaliseret i forhold til gennemsnittet af de absorbanser, der er opnået med de PEI-behandlede standardplader, som fik den arbitrære værdi 100,0 %. Resultaterne viser, at PEI-belægningen forbliver stabil på plastskålens overflade i mindst 10 dages køletid, og at den ikke fjernes ved inkubation ved 37 °C i mediet eller endog ved gentagne medieskift. Resultaterne er repræsentative for 4 uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer.

PEI-forbehandling forbedrer lipofektion af svagt forankrende celler

Transfektion af eukaryote celler ved lipofektion involverer flere trin, medietilsætninger og udskiftninger, hvilket kan tage hårdt ud i svagt forankrende celler. Selv om man er omhyggelig med at undgå tab af celler, kan de svagt forankrede celler være mindre effektive i optagelsen af transfektionskomplekserne. Da PEI-forbehandling af cellekulturskåle øger cellernes vedhæftningsstyrke til sådanne overflader, blev det antaget, at vedhæftningsfaktoren kan have en positiv virkning på det transfektionsudbytte, der opnås ved lipofektion. De tre ovenfor beskrevne cellelinjer blev anvendt til at teste denne hypotese ved hjælp af de tidligere undersøgte overfladebehandlingsmidler. Transfektioner blev udført med et plasmid, der koder for reporterenzymet β-galactosidase. Transfektionsudbyttet blev overvåget ved bestemmelse af reporterenzymaktiviteten i lysater fra de transficerede celler. Der blev udført mindst to uafhængige analyser i tre eksemplarer med hver cellelinje. Repræsentative plotter er vist i figur 5. Udbyttet (β-galactosidaseaktiviteter) blev normaliseret i forhold til den aktivitet, der blev opnået med PEI-forcoating, som blev sat som reference til 100,0 %. Generelt blev det observeret, at transfektionsudbyttet blev forbedret i de svagt forankrende celler ved præ-belægning med midler, der fremmer cellernes fastgørelse til pladen. I tilfælde af PC-12-celler resulterede forbelægning af brønde med PEI, kollagen eller PDL i en 2- til 3-dobbelt forøgelse af transfektionsudbyttet i forhold til de ubehandlede brønde: relative udbytter på 100,0 % ± 1,4 % for PEI, 87,0 % ± 8,7 % for kollagen og 100,1 % ± 2,4 % for PDL mod 42,9 % ± 2,2 % for de ubehandlede brønde (figur 5A). Forbedringen af transfektionsudbyttet ved PEI-forbehandling var mere udtalt for HEK-293-celler. Forsøget i figur 5B viser en relativ aktivitet på 21,1 % ± 3,4 % for cellerne i de ubehandlede brønde sammenlignet med 100,0 % ± 8,4 % for de PEI-forbehandlede brønde (ca. 5-dobbelt stigning). Forbehandling med kollagen eller PDL resulterede i mere beskedne induktioner (ca. 2- til 3-dobbelt i figur 5B). Den laveste forbedring blev observeret med kollagen, svarende til den lavere forbedring af vedhæftning af HEK-293-celler, som tidligere blev observeret i Figur 3B. Endelig blev der for de stærkt vedhæftede MYS-fibroblaster ikke observeret en signifikant positiv effekt ved at anvende vedhæftningsfaktorer i transfektionsproceduren. Variationerne var normalt mindre end 20 % for alle forsøgsbetingelserne. Det repræsentative forsøg, der er vist i figur 5C, viser faktisk et lidt højere transfektionsudbytte for de ubehandlede brønde end for de PEI-forbehandlede plader (relativ aktivitet på 117,7 % ± 3,2 % for de ubehandlede brønde mod 100,0 % ± 4 % for de PEI-forbehandlede brønde).8 % for de PEI-forbehandlede brønde, eller ca. 1,2 gange højere transfektionsudbytte i kontrollen).

Ved at samle resultaterne fra alle de udførte eksperimenter var den gennemsnitlige fold-fremgang (± standardafvigelse), der blev observeret i transfektionsudbyttet af PC-12-celler, der var forankret på PEI, sammenlignet med celler på ubehandlede brønde, 2.4-fold (± 0,1-fold; n = 3), mens forøgelsen med HEK-293-celler var 6,3-fold (± 0,5-fold; n = 2). t-test statistisk analyse viser, at begge stigninger er signifikante (p < 0,05). Der blev ikke observeret nogen signifikant transfektionsforbedring i forsøgene med MYS-celler, med en gennemsnitlig foldændring på 1,0-fold (± 0,3-fold; n = 2) ved forbehandling med PEI (stort set identisk med udbyttet uden behandling).