Principper for samlingsprincipper fra in vitro undersøgelser
Funktionelle bakterielle 30S og 50S ribosomale underenheder kan rekonstitueres in vitro fra rRNA plus hvert af de ribosomale proteiner. Detaljerede undersøgelser af de biokemiske og biofysiske principper, der ligger til grund for ribosom-sammensætning in vitro, har givet nyttige paradigmer til at styre undersøgelser af ribosom-biogenese in vivo.
Et af de første principper, som disse eksperimenter har afsløret, er, at sammensætningen af r-proteiner til ribosom-underenheder sker på en hierarkisk måde. Rekonstitutionsstudier af bakterielle 30S ribosomale underenheder definerede et “samlingskort” for rækkefølgen af hvert r-proteins tilknytning til rRNA. På grundlag af deres rækkefølge i bindingshierarkiet betegnes r-proteiner som primære (binding direkte til rRNA), sekundære (binding er afhængig af primære bindingsproteiner) eller tertiære proteiner (binding er afhængig af sekundære bindingsproteiner). Selv om et sådant afhængighedskort har vist sig at være et meget nyttigt udgangspunkt, giver det ikke nogen oplysninger om proteinbindingens kinetik. Snarere kan samlingsvejen i høj grad afspejle den rækkefølge, i hvilken hvert r-protein er mest stabilt associeret med rRNA. Desuden tager samlingskortet ikke hensyn til hverken 16S rRNA’s foldningsvej uafhængigt af r-proteiner eller til den rolle, som nukleolytisk behandling af rRNA-prækursorer, der finder sted in vivo, spiller for ribosom-samlingen. For nylig er disse aspekter af samling af 30S-underenheden blevet udforsket mere detaljeret ved hjælp af teknikker som kemisk og hydroxylradikalsk sondering af RNA-konformationen for at undersøge ændringer i rRNP-konformationen med tiden og pulse-chase/massespektrometri (PC/MS) for at bestemme kinetikken af r-proteinbinding til rRNA.
En mulig forklaring på observationen af primære bindende r-proteiner i samlingskortet er, at deres bindingssteder skabes i det mindste delvist af den konformation, som 16S rRNA antager uafhængigt af r-proteiner. I overensstemmelse med denne idé og det synspunkt, at ribosomer har udviklet sig fra en RNA-katalysator, er det faktisk blevet vist, at 5′-domænet af 16S rRNA kan folde sig og danne tertiære kontakter i fravær af alle r-proteiner. Denne tertiære struktur er formentlig ikke helt stabil i fravær af proteinkontakter og stabiliseres derfor højst sandsynligt ved at binde r-proteiner til steder, der er skabt af forbigående konformationer, som rRNA indtager, når det gennemgår foldning. Derfor tyder det andet princip på, at rRNA-foldning danner grundlaget for r-proteinbinding under ribosom-samlingen.
Et tredje princip, der er fremkommet ved in vitro-undersøgelser af bakterielle ribosomer, er, at en styrkelse af r-proteinbindingen med rRNA sker, efterhånden som ribosom-samlingen skrider frem. Mange r-proteiner kontakter flere nukleotider på rRNA. Tidsopløst hydroxylradikal footprinting har afsløret, at nogle af disse nukleotider er beskyttet før andre, hvilket tyder på, at efterhånden som ribosombiogenesen skrider frem, skaber r-proteiner flere kontakter med rRNA og bliver derved mere stabilt integreret med ribosomer.
Den indledende etablering af nogle få kontakter mellem r-proteiner og rRNA stabiliserer potentielt visse RNA-konformationer og inducerer ændringer i rRNA-konformationen for at give bindingssteder for yderligere (sekundære eller tertiære) r-proteiner. Derfor konsoliderer r-proteinbinding RNA-foldningsgevinster og giver samlingsprocessen retningsbestemthed. Dette tyder på en model, hvor samlingen foregår gennem en vekslende serie af RNA-konformationsændringer og proteinbinding, som sekventielt stabiliserer den endelige RNA-struktur. Kinetiske data har afsløret, at samling af modne 30S-underenheder sker via flere parallelle RNA-foldningsveje, som alle konvergerer mod det endelige produkt. Dette har ført til begrebet om et samlingslandskab i modsætning til en unik vej, som samlingen af ribosomale underenheder sker over.
Endelig har in vitro-undersøgelser afsløret, at ribosom-samlingen sker i 5′-til-3′-retningen. PC/MS og kemisk sondering af sekundærstrukturen af rRNA har vist, at r-proteinbinding til 5′-domænet af rRNA kan observeres, før der etableres proteinkontakter med 3′-domænet af rRNA. I modsætning hertil viste hydroxylradikale fodaftryksanalyser en indledende udbrud af nukleotidbeskyttelse langs hele 16S rRNA, hvilket indikerer, at RNA-foldningen danner kerner fra mange forskellige steder spredt over hele RNA’et og dermed peger på en mangel på 5′-til-3′-retningsmæssighed i samlingen. Disse modstridende observationer kan forenes ved at tage hensyn til arten af de forskellige eksperimentelle opsætninger. PC/MS måler kinetikken af proteinbinding til rRNA, og som sådan kan kun stabile r-protein-rRNA-interaktioner påvises, fordi r-proteiner, der binder svagt i løbet af pulsen, kan vaskes af i løbet af jagten. Footprinting-assays kan derimod opfange nukleotidbeskyttelse af både svagt interagerende og stabilt associerede r-proteiner. Samlet set tyder disse data på, at mens ribosom-samlingen kan foregå i kerner på tværs af hele rRNA, sker den endelige tætte associering af r-proteiner med rRNA i 5′- til 3′-retningen.
Det er vigtigt at overveje, hvordan disse in vitro-forsøg måske eller måske ikke afspejler samlingen in vivo. For eksempel, når ribosom samling sker in vivo, er den koblet med transkription af rRNA, hvilket formodentlig også bidrager til den observerede 5′-til-3′-retningsmæssighed af r-proteinsammenslutningen. rRNA kan have udviklet sig til at folde sig 5′ til 3′, når det syntetiseres, og til at inkorporere r-proteiner på denne måde, hvorved samling kobles med transkription af rRNA. Desuden tyder kravet om et opvarmningstrin under rekonstruktionen af ribosomale underenheder in vitro og identifikationen af en række bakteriemutanter, der er defekte i produktionen af ribosomer, på behovet for transvirkende faktorer under ribosombiogenese in vivo.