Basofilaktiveringstest: fødevareudfordring i et reagensglas eller specialiseret forskningsværktøj?

Den gyldne standard til diagnosticering af fødevareallergi er oral fødevareudfordring (OFC) . OFC kræver imidlertid indtagelse af den formodede skyldige fødevare og kan forårsage en akut allergisk reaktion, som kan være alvorlig . Derfor skal OFC udføres i et overvåget miljø med faciliteter og ekspertise til at behandle allergiske reaktioner og anafylaksi, hvis de skulle opstå. OFC kan forårsage betydelig angst hos patienter, forældre og endda hos det kliniske personale, da det indebærer en betydelig risiko. Diagnosen fødevareallergi stilles derfor så vidt muligt på grundlag af en nyere overbevisende historie med en IgE-medieret allergisk reaktion over for den skyldige fødevare kombineret med bevis for IgE-sensibilisering over for den samme fødevare ved hjælp af hudpriktest (SPT) og/eller serumspecifik IgE (sIgE) . OFC er forbeholdt de tilfælde, hvor resultaterne af SPT og/eller sIgE er tvetydige. Med den øgede bevidsthed om og den øgede prævalens af fødevareallergi og fødevaresensibilisering bliver flere og flere patienter testet for fødevareallergi. Manglende historik for oral eksponering for allergifremkaldende fødevarer, enten med en allergisk reaktion til følge eller uden kliniske symptomer, kan gøre fortolkningen af resultaterne af SPT og sIgE særlig vanskelig. Spædbørn og småbørn, som aldrig har fået visse allergifremkaldende fødevarer, udgør en betydelig del af de patienter, der ses på allergiklinikkerne, og de har ofte brug for en OFC for at klarlægge deres allergiske status. Dette resulterer i en stigende efterspørgsel efter OFC-undersøgelser. Allergitjenesterne har svært ved at imødekomme denne efterspørgsel, og patienterne kan være nødt til at vente flere måneder, før de får tilbudt en nøjagtig diagnose af fødevareallergi eller fødevaretolerance ved OFC, hvilket kan føre til unødvendige kostrestriktioner og til betydelig angst i forbindelse med diagnostisk usikkerhed. OFC er også den bedste standard til at vurdere, om fødevareallergi er løst, til at bestemme tærskeldosis og til at overvåge det kliniske respons på immunmodulerende behandlinger for fødevareallergi. I forskningsundersøgelser skal allergiske patienter ofte gennemgå gentagne OFC for at vurdere, om der er sket en klinisk forbedring.

BAT, der er en funktionel test, har potentiale til at ligne patienternes kliniske fænotype mere end allergitests, der blot påviser tilstedeværelsen af allergenspecifikke IgE. BAT kan forenklet sagt ses som en OFC i et reagensglas, hvor basofiler, der er involveret i akutte allergiske reaktioner, i stedet for at give fødevaren til et barn gennem munden, udsættes for et fødevareekstrakt i et reagensglas. På trods af analogien kan der påpeges forskelle mellem de to procedurer og deres kliniske anvendelse, og her ligger spørgsmålet om, hvorvidt BAT loyalt kan efterligne guldstandarden OFC, dvs. om BAT in vitro kan reproducere den allergiske reaktion, der sker in vivo under en positiv OFC.

Basofilaktiveringstest

BAT er et flowcytometri-baseret assay, hvor ekspressionen af aktiveringsmarkører måles på overfladen af basofiler efter stimulering med allergen -Fig. 1. En positiv basofilaktiveringstest kan ses som et in vitro-surrogat for en akut allergisk reaktion in vivo. I en undersøgelse af patienter, der var allergiske over for hymenoptera-gift, blev der observeret en opregulering af basofile aktiveringsmarkører både in vitro efter stimulering med gul jakke- eller honningbi-gift og ex vivo efter en positiv stikudfordring . I den samme undersøgelse var der en generel overensstemmelse mellem den kliniske præsentation (systemisk reaktion versus stor lokal reaktion) og resultaterne af BAT, hvilket tyder på, at BAT er en potentiel biomarkør for anafylaksi. Også hos fødevareallergiske patienter blev der fundet en god overensstemmelse mellem resultaterne af BAT og resultatet af OFC. Hos patienter med alfa-gal-allergi med forsinkede allergiske reaktioner af umiddelbar type over for rødt kød faldt aktiveringen af basofile ex vivo i blod, der blev indsamlet på forskellige tidspunkter, sammen med udviklingen af systemiske allergiske reaktioner in vivo under OFC . Resultaterne af denne undersøgelse styrker den rolle, som basofiler spiller i fødevareinducerede IgE-medierede allergiske reaktioner og anafylaksi.

Differente celleoverflademarkører kan anvendes til at identificere basofile i fuldblod, herunder IgE, CD123 (med HLA-DR), CCR3 eller CRTH2 (med CD3) eller CD203c .

I perifert blod påvises IgE på basofile, dendritiske celler, eosinofile, monocytter, makrofager, B-celler og trombocytter, og det er således ikke specifikt for basofile. CD123 er den lavaffinitets (α)-underenhed af IL-3-receptoren. Den udtrykkes i høje niveauer på plasmacytoide dendritiske celler og basofiler og i lave niveauer på monocytter, eosinofile, myeloide dendritiske celler og undergrupper af hæmatologiske progenitorceller. Ved yderligere farvning med HLA-DR kan der skelnes mellem HLA-DR-negative basofiler og HLA-DR-positive dendritiske celler og monocytter. CCR3 er receptor for kemokiner af C-C-typen (f.eks. eotaxin, MCP og RANTES) og er stærkt udtrykt på basofile og eosinofile, men også på Th1- og Th2-celler. CRTH2 er en anden markør, der udtrykkes af basofile, eosinofile og T-celler, og som CCR3 kræver det således en T-cellemarkør, f.eks. CD3, for at skelne basofile fra T-celler. CD203c udtrykkes konstitutivt og specifikt på basofiler og kan derfor anvendes som en enkelt identifikationsmarkør eller i kombination med andre markører.

Efter stimulering med allergen opreguleres ekspressionen af forskellige proteiner på overfladen af basofiler , nemlig CD63 og CD203c . CD63 er et lysosomal-associeret membranprotein (LAMP), som ikke udtrykkes på overfladen af basofile i hvile, men kun på membranen af granulerne inde i cellerne . Når granulerne smelter sammen med basofilernes plasmamembran under degranulering, kommer CD63 til udtryk på basofilernes overflade . CD203c er et enzym, der spalter phosphodiester- og phosphosulfatbindinger og hydrolytisk fjerner 5′-nukleotider successivt fra 3′-hydroxy-terminalerne af oligonukleotider. Det udtrykkes udelukkende og konstitutivt i lave niveauer på overfladen af basofile og mastceller, og dets ekspression øges med celleaktivering. Basofile aktiveringsmarkører synes at danne to forskellige grupper af markører, der opreguleres samtidig: en gruppe, der omfatter CD63, CD107a og CD107b, og en anden, der omfatter CD203c, CD13 og CD164 . CD63 og CD203c er de mest almindeligt anvendte basofile aktiveringsmarkører.

Laboratorieproceduren for BAT består af tre faser: cellestimulering, cellefarvning og flowcytometri – fig. 1. Blodet bør behandles så hurtigt som muligt efter blodudtagningen, da basofile mister deres levedygtighed og reaktivitet med tiden. Der er dog gennemført undersøgelser med prøver, der er opbevaret ved +4 °C i op til 24 timer . Der kræves en lille mængde blod (ca. 1-2 ml afhængigt af antallet af betingelser) til BAT. Der kan anvendes rå allergenekstrakter eller oprensede eller rekombinante allergener til cellestimulering. Der bør anvendes forskellige allergenkoncentrationer, da basofilernes følsomhed over for specifik allergenstimulering varierer fra patient til patient.

Resultaterne af BAT kan bestemmes i procent af basofiler, der udtrykker den definerede aktiveringsmarkør, eller i gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) ved at beregne stimulationsindekset, dvs. forholdet mellem MFI for den valgte tilstand og MFI for den negative kontrol. Førstnævnte metode anvendes normalt for CD63, da CD63 ikke udtrykkes i hvilende celler, og da dens udtryk efter aktivering er bimodalt. Sidstnævnte anvendes normalt for CD203c, som allerede udtrykkes i hvilende celler, og dens stigning efter allergenstimulering er unimodal-figur 2.

I allergiske patienter resulterer allergeninduceret basofilaktivering typisk i en klokkeformet dosis-respons-kurve, hvor stigende koncentrationer af allergenet (normalt 5-6 logdifference) fører til en progressiv stigning i ekspressionen af basofile aktiveringsmarkører, indtil der nås et plateau-fig. 3.

Der er en stor grad af variabilitet i basofilresponset på allergen mellem individer. For at udtrykke denne heterogenitet og for at sammenligne basofile responser mellem forskellige patienter kan forskellige parametre bestemmes på grundlag af dosis-respons-kurven, såsom CD-max og EC50 (50 % effektiv koncentration) eller CDsens. CD-max er den maksimale aktivering og svarer til den maksimale andel af aktiverede basofiler ved en hvilken som helst allergenkoncentration . EC50 er den effektive dosis ved 50 % af den maksimale aktivering og kan også repræsenteres som CDsens. CDsens, der først blev beskrevet af Johansson , er den inverse af den halvmaksimale effektive koncentration, dvs. den koncentration, ved hvilken basofilaktiveringen er halvdelen af den maksimale aktivering, gange 100 og kan beregnes ved hjælp af formlen: CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax og CDsens er mål for henholdsvis basofil reaktivitet og basofil følsomhed. Basofilreaktivitet kan defineres som graden af basofilaktivering, dvs. andelen af aktiverede basofiler, og kan også måles som procentdelen af CD63-positive basofiler ved forskellige allergenkoncentrationer eller som forholdet mellem procentdelen af CD63-positive efter stimulering med allergen og med anti-IgE. Basofilfølsomhed henviser til den allergenkoncentration, ved hvilken basofiler aktiveres, og kan udtrykkes som en procentdel af den maksimale effektive dosis (f.eks. EC5, EC10), bortset fra EC50 og CDsens, som tidligere nævnt. Figur 3 viser basofilresponset hos to forskellige personer, den ene med højere basofilreaktivitet og -følsomhed (blå) og den anden med lavere basofilreaktivitet og -følsomhed (rød), dvs. med en mindre andel af basofiler, der aktiveres som reaktion på højere koncentrationer af allergenet. Shreffler og Patil har foreslået en ny parameter til måling af basofile reaktioner, arealet under dosis-respons-kurven, som har den fordel at kombinere basofil reaktivitet og basofil følsomhed.

Anvendelse af basofil aktiveringstest til at diagnosticere fødevareallergi

I en nyligt offentliggjort undersøgelse , vurderede vi anvendeligheden af BAT til at diagnosticere jordnøddeallergi i en velkarakteriseret population af jordnøddeallergiske, jordnøddesensibiliserede og ikke-sensibiliserede børn. BAT viste høj nøjagtighed (97 %) ved diagnosticering af jordnøddeallergi og muliggjorde en reduktion i antallet af nødvendige OFC’er med 66 %. Vi validerede de diagnostiske cut-offs i en prospektivt og uafhængigt rekrutteret population, og BAT’s diagnostiske ydeevne var stadig meget god i denne anden undersøgelsespopulation. I de seneste år har andre undersøgelser vurderet BAT’s ydeevne ved diagnosticering af allergi over for forskellige fødevarer, herunder jordnødder , komælk , æg , hvede , hasselnød , skaldyr og fersken , samt ved diagnosticering af pollen-fødevaresyndromer – Tabel 1. Caserapporter og små serier af tilfælde har antydet, at BAT også kan være nyttig til at diagnosticere allergi over for sesam og mindre almindelige udløsere af IgE-medierede fødevareallergiske reaktioner, såsom ris og kortkædede galacto-oligosaccharider i præbiotika . Et nyligt offentliggjort positionspapir fra European Academy of Allergy and Clinical Immunology gennemgår de kliniske anvendelser af BAT.

Flere faktorer kan påvirke BAT’s diagnostiske ydeevne og cut-off-værdier i forskellige undersøgelser, nogle relateret til undersøgelsespopulationen, nogle relateret til undersøgelsesdesignet, nogle relateret til laboratorieproceduren og til den metode, der er anvendt til dataanalyser – Tabel 2. De eksisterende undersøgelser er heterogene med hensyn til de fleste af disse aspekter, hvilket begrænser deres sammenlignelighed og en bredere anvendelse af de diagnostiske cut-off-værdier, der er fastsat i specifikke undersøgelser. Kriteriet for diagnosticering af hver enkelt fødevareallergi er allergenspecifikt, og den diagnostiske nøjagtighed er muligvis ikke den samme for forskellige allergener. Desuden kan de cut-offs, der er defineret i en population, ikke nødvendigvis overføres direkte til en anden population fra et andet geografisk sted, der er vurderet i et andet allergicenter. En begrænsning ved BAT er, at en lille del af de testede patienter har basofiler uden respons (dvs. basofiler, der reagerer på en ikke-IgE-medieret positiv kontrol, men ikke på IgE-medierede stimulanser) og derfor har et ufortolkeligt resultat for testen. Yderligere udfordringer i forbindelse med at omsætte BAT fra en forskningsmetode til en diagnostisk test i klinikken er relateret til standardiseringen af assayet og dets reproducerbarhed og også til omkostningseffektiviteten af at inddrage BAT i den diagnostiske tilgang til patienter med mistanke om fødevareallergi. Disse aspekter er endnu ikke fastlagt og kræver yderligere forskning.

Den metode, der anvendes til at udføre laboratorieproceduren og analysere flowcytometridataene, kan have en betydelig indvirkning på de resultater, der opnås for BAT, og dermed på dens diagnostiske nøjagtighed. F.eks. kan identifikation af basofiler ved hjælp af et anti-IgE-antistof aktivere cellerne og ændre de resultater, der opnås med en anden metode til identifikation af basofiler. Udtrykket af visse basofile identifikationsmarkører, f.eks. CCR3 og CD123, kan ændre sig efter aktivering af basofile. I en nylig undersøgelse beskrev vi, at hos ca. en fjerdedel af patienterne kan ekspressionen af CD123, som påvist ved flowcytometri, reduceres efter basofilaktivering og derfor føre til et betydeligt tab af aktiverede celler ved hjælp af metoder, der er afhængige af denne markør til identifikation af basofile. Dette kan resultere i et øget antal fejldiagnoser, især falsk-negative, med vigtige konsekvenser for de enkelte patienter. Ved at tilføje den basofilspecifikke markør CD203c til gating-strategien blev celleantallet bevaret, og det blev muligt at reducere antallet af falsk-negative resultater (fra 5 til 1 %). Den ændrede gating-strategi forbedrede både følsomheden (fra 88 til 98 %) og specificiteten (fra 94 til 96 %) af BAT, hvilket resulterede i en samlet forbedring af BAT’s nøjagtighed med hensyn til at diagnosticere jordnøddeallergi fra 91 til 97 % – fig. 4. For at gennemføre og fortolke BAT med succes er “djævelen i detaljen”; derfor er det meget vigtigt at overveje de metodologiske aspekter af BAT nøje.

Samlet set har BAT som diagnostisk test vist høj specificitet og positiv prædiktiv værdi. Vi validerede de diagnostiske cut-offs, der er fastlagt for jordnøddeallergi, i en uafhængig prospektivt rekrutteret population, og BAT’s specificitet og positive prædiktive værdi nåede op på 100 %. Den høje specificitet er et vigtigt supplement til de eksisterende allergitests, såsom SPT og sIgE, som har høj sensitivitet, men ikke er særlig specifikke. Den høje specificitet indebærer, at en positiv BAT bekræfter diagnosen fødevareallergi med sikkerhed, men at en negativ BAT ikke nødvendigvis udelukker diagnosen. Afhængigt af cost-benefit-forholdet og sikkerhedsaspekterne kan OFC foretages hos patienter, hvor BAT giver et ukonklusivt resultat (nemlig patienter med non-responder basofiler), eller hos patienter, hvor BAT giver et ukonklusivt resultat, og hos patienter, hvor BAT var negativ.

Måden at træffe beslutning om behovet for OFC efter BAT afhænger også af, hvordan resultatet af BAT betragtes i forbindelse med resultaterne af andre allergitests, enten i kombination, når alle tilgængelige resultater betragtes samtidig, eller sekventielt, hvor BAT kun udføres hos patienter, der havde tvetydige eller uoverensstemmende resultater af de andre allergitests. I vores tidligere omtalte jordnøddeundersøgelse sammenlignede vi resultaterne af BAT med resultaterne af andre allergitest, der blev udført parallelt. BAT klarede sig bedre end SPT, specifik IgE mod jordnødder og specifik IgE mod Ara h 2 og andre jordnøddekomponenter. Når man ser på de enkelte test, var BAT den mest præcise diagnostiske test. For at få mest muligt ud af de tilgængelige oplysninger kan resultaterne af BAT anvendes i kombination med resultaterne af andre test . Generelt gælder det dog, at jo flere test der anvendes, jo større er den diagnostiske usikkerhed (og jo større er antallet af OFC), da forskellige test kan give modstridende resultater . Det kan være bedre end at kombinere resultaterne af allergitestene samtidigt at anvende BAT i rækkefølge i den diagnostiske behandling af fødevareallergi hos patienter, som ikke har fået et entydigt resultat af de andre allergitest . Denne fremgangsmåde kan også være fordelagtig ud fra et gennemførlighedssynspunkt i betragtning af de praktiske forhold, der er forbundet med udførelsen af BAT, nemlig behovet for frisk blod og de ressourcer og den tekniske ekspertise, der kræves. Det ville ikke være praktisk eller endog nødvendigt at udføre BAT hos alle de patienter, der undersøges for mistanke om fødevareallergi. BAT kan forbeholdes udvalgte tilfælde, især tilfælde, hvor der ikke er nogen anamnese om oral eksponering for fødevaren, eller hvor den kliniske historie er uklar, og resultaterne af SPT og specifik IgE ikke er entydige . BAT kan i vanskelige tilfælde anvendes som et andet trin i det diagnostiske arbejde efter den kliniske historie og SPT og/eller sIgE, før det besluttes, om der er behov for en OFC – fig. 5. Den diagnostiske nøjagtighed og BAT’s overlegenhed i forhold til hudpriktest og specifik IgE skal vurderes med andre allergener og i andre kliniske sammenhænge.

Ud over at skelne mellem fødevareallergiske og fødevaretolerante patienter kan resultaterne af BAT give yderligere oplysninger om karakteristika ved fødevareinducerede reaktioner, som kan være nyttige i behandlingen af allergiske patienter . Forskellige parametre i BAT har vist sig at afspejle forskellige karakteristika ved de allergiske reaktioner, idet andelen af aktiverede basofiler (basofilreaktivitet) afspejler sværhedsgraden af allergiske symptomer, og den dosis, ved hvilken basofiler reagerer på allergen in vitro (basofilfølsomhed), afspejler den dosis fødevareprotein, ved hvilken patienterne reagerede under OFC . Disse resultater i forbindelse med jordnøddeallergi er blevet gentaget i en efterfølgende offentliggjort undersøgelse og kan muligvis også anvendes på andre fødevareallergier. Under alle omstændigheder bør resultatet af BAT tages i sammenhæng med andre kliniske træk og risikofaktorer for sværhedsgrad, når man vurderer fødevareallergiske patienter.

Anvendelse af basofilaktiveringstesten til at overvåge erhvervelse af tolerance over for fødevarer og det kliniske respons på immunmodulerende behandlinger for fødevareallergi

Gennemgående afspejler den kliniske fænotype af allergiske og tolerante patienter, BAT kan være nyttig til at vurdere den naturlige opløsning af fødevareallergier, som normalt vokser over med tiden, såsom komælks-, æg- og hvedeallergi, og til at bestemme, hvornår patienterne skal udfordres igen for at vurdere, om fødevaren kan genindføres i kosten. BAT har vist sig at kunne skelne mellem forskellige fænotyper af patienter med komælk- og ægallergi, nemlig patienter, der tåler stærkt opvarmede former af disse fødevarer, mens de stadig reagerer på uopvarmede fødevarer, og patienter, der reagerer på både stærkt opvarmet og uopvarmet mælk eller æg .

BAT er også blevet anvendt til at overvåge det kliniske respons på immunmodulerende behandlinger for fødevareallergi i forskningsundersøgelser. Overordnet set har BAT i undersøgelser af immunterapi mod fødevarer som jordnødder , komælk og æg vist nedsat basofilreaktivitet over for de respektive fødevareallergener ved behandling, hvilket er særligt tydeligt ved de lavere koncentrationer af allergenet, hvilket afspejler faldet i basofilfølsomhed. Det er interessant, at Thyagarajan et al. viste, at under jordnødde-OIT skete reduktionen i basofilaktivering ikke kun som reaktion på jordnøddeallergi, men også på det sekundære ægallergen (hos ægallergiske patienter) og på anti-IgE, men ikke på den ikke-IgE-medierede positive kontrol, fMLP (formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin), hvilket tyder på, at vejen nedstrøms IgE-receptoren var blevet anergisk. I en undersøgelse af omalizumab hos jordnøddeallergiske patienter faldt CD203c-ekspressionen i BAT under behandlingen og vendte tilbage til niveauet før behandlingen efter ophør af denne behandling. Endelig viste den kinesiske urtemedicin FAHF-2 også en signifikant hæmmende effekt på basofilresponset hos patienter med allergi over for forskellige fødevarer parallelt med klinisk forbedring.

Sammen illustrerer disse undersøgelser, at BAT kan gentages hos de samme patienter over tid for at vurdere ændringerne i immunresponset over for fødevareallergener med en eller anden form for intervention, hvad enten det er oral immunterapi, sublingual immunterapi, omalizumab eller andre immunmodulerende terapeutiske eller forebyggende strategier.

Fremtidige perspektiver

Med henblik på at anvende BAT til diagnosticering af fødevareallergi i klinisk praksis er der behov for yderligere forskning for at definere og validere diagnostiske cut-offs for specifikke allergener og i forskellige patientpopulationer. Standardisering af laboratorieprocedurerne vil være vigtig for at muliggøre sammenlignelighed af resultaterne af BAT mellem forskellige centre. Dette vil kræve standardisering af protokollen for in vitro-assayet og af flowcytometri- og dataanalysemetoderne. Anvendelse af lignende metoder til BAT vil gøre det muligt at sammenligne resultaterne af BAT i forskellige centre, både til kliniske og forskningsmæssige formål, herunder i multicenterundersøgelser.

Når BAT er valideret på passende vis til diagnosticering af specifikke fødevareallergier, kan den anvendes til at overvåge det kliniske respons på immunmodulerende behandlinger såsom allergen-specifik immunterapi og biologiske lægemidler. BAT har også et enormt potentiale for mekanistiske undersøgelser for at forbedre vores forståelse af basofils rolle i immunmekanismerne ved fødevareallergi og fødevaretolerance.