ORIGINALPAPER
Beskrivelse af et udbredt udbrud af aseptisk meningitis forårsaget af echovirus 30 i staten Rio de Janeiro, Brasilien
Vitor Laerte Pinto JuniorI; Maria Cristina RebeloII; Eliane Veiga da CostaIII; Edson Elias da SilvaIII; Márcio Neves BóiaIV
IDiretoria Regional de Brasília, Fiocruz, Brasília, DF
IILaboratório de Referência Estadual para Meningites, Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião, Rio de Janeiro, RJ
IIILaboratório de Enterovirus, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ
IVPós-graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ; Brasilien
Korrespondanceadresse
ABSTRACT
Echovirus 30 tilhører slægten Enterovirus og er i vid udstrækning forbundet med udbrud af aseptisk meningitis (AM). I Brasilien er der rapporteret om epidemier forårsaget af denne serotype i flere stater, men i Rio de Janeiro var den før denne undersøgelse kun involveret i sporadiske episoder. Vi indsamlede retrospektivt data fra AM-meddelelsesjournaler og enterovirusisolationsdatabasen fra Rio de Janeiro State Health Department (RJSHD) og Enterovirus Reference Laboratory i 2005. Der blev påvist et udbrud af AM i marts, april og maj i forbindelse med en høj cellekulturisolationsrate for echovirus 30 (17,4 %). Mandlige børn i alderen fra 1 til 9 år var mest ramt. Af de 22 patienter med bekræftet echovirus 30-sygdom var der kliniske oplysninger om otte af dem; feber, hovedpine og opkastninger var de mest almindelige manifestationer. CSF-analyse viste et typisk mønster af virusinfektion med en median for cellularitet på 100 celler/mm3 og mononukleære celler dominerede i 64,7 % af tilfældene. Medianen for protein- og glukoseniveauer var 49 mg/dL og 56,5 mg/dL. Dødelighedsprocenten var nul. På trods af det godartede forløb og manglen på behandlingsmuligheder er overvågning af aseptisk meningitis afgørende for tidlig identifikation af forårsagende agenser i udbrud, hvilket bidrager til at undgå yderligere testning og uhensigtsmæssig brug af antimikrobielle midler.
Nøgleord: Aseptisk meningitis, enterovirus, echovirus, cerebrospinalvæske.
Aseptisk meningitis (AM) er et syndrom, der er karakteriseret ved akut indsættende feber og meningisme sammen med analyse af cerebrospinalvæske (CSF), der typisk viser mononukleær celleprædominans og negativ bakteriologisk undersøgelse . Med den udbredte brug af virusvacciner (hovedsagelig polio, fåresyge og mæslinger) er ikke-polio enterovirus i dag blevet den vigtigste årsag til infektiøs AM, der er ansvarlig for både sporadiske og epidemiske tilfælde . Diagnosen af non-polio enterovirus i Brasilien er begrænset til forskningscentre, hvor kliniske prøver kun testes med henblik på epidemiologisk overvågning ved hjælp af viral kultur eller PCR.
Echovirus 30 tilhører slægten Enterovirus og er hovedsagelig forbundet med tilfælde af AM med et epidemisk mønster. Denne serotype har øget sin forekomst, og i de seneste år er den blandt de hyppigst påviste enterovirus . I Brasilien er den allerede blevet rapporteret som årsag til udbrud af AM i flere delstater (Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Pernambuco og Pará), hvor den hyppigst rammer ældre børn og voksne og har en lav dødelighedskvotient .
Mellem marts og maj 2005 opstod der et udbrud af AM i hovedstadsområdet i staten Rio de Janeiro samtidig med et overnormalt højt niveau af bekræftet isolering af echovirus 30 fra CSF og fæces fra patienter med dette syndrom. Kliniske, laboratoriemæssige og epidemiologiske data rapporteres i denne undersøgelse.
Materiale og metoder
Subjekter
I denne retrospektive undersøgelse blev de epidemiologiske og demografiske data for 573 anmeldte tilfælde af AM i 2005 gennemgået og analyseret fra databasen for det rådgivende udvalg for meningitis i Rio de Janeiros statslige sundhedsministerium (RJSHD). AM blev betragtet som AM i alle tilfælde med følgende kriterier: patienter i alle aldre med symptomer på akut meningitis (feber, hovedpine, opkastning, stivhed i nakken og irritabilitet eller sløvhed) sammen med en CSF-profil, der viste et antal hvide celler på > 10 celler/mm3 og negativ bakteriologisk undersøgelse.
Kliniske data for de patienter, der blev behandlet på Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião (IEISS), Rio de Janeiro, med bekræftet echovirus 30-infektion, blev indhentet fra patienternes journaler og fra Enterovirus Reference Laboratory-databasen. Der blev indsamlet data om alder, køn, tegn og symptomer, comorbiditeter, indledende CSF-analyseresultater og klinisk resultat på tidspunktet for udskrivelsen fra hospitalet.
CSF-analyse af kliniske prøver
Alle patienter gennemgik en lumbalpunktur med henblik på vurdering af meningitis; ingen patienter blev underkastet denne procedure udelukkende med henblik på at indsamle prøver til undersøgelsen. CSF blev analyseret for celleindhold, protein- og glukoseniveauer og bakteriologiske tests ved hjælp af laboratorierutinemetoder.
Virusisolering og -identifikation
Alle prøver (CSF og fækale ekstrakter fra patienter, der undersøger AM) blev inokuleret i mængder på 0,2 mL på cellekulturer med henblik på virusisolering. Kontinuerlige cellelinjer RD (humant rhabdomyosarcoma) og HEp2 (humant larynxkarcinom) blev udvalgt for deres evne til at understøtte de fleste enterovirus-serotyper replikation . Rørene blev opbevaret ved 36ºC i syv dage, underkastet en blindpassage og opbevaret ved 36ºC i yderligere syv dage. Cellekulturer, der viste cytopatisk effekt (CPE), blev opbevaret ved -20ºC indtil yderligere identifikation.
Spekimenter, der viser enteroviruskarakteristisk CPE, blev underkastet RNA-ekstraktion ved hjælp af Trizol LS ® (Life Technologies) i overensstemmelse med producentens protokol. Specifik Enterovirus gruppe-RT-Polymerase Chain Reaction blev udført ved hjælp af et primerpar (R – 222 og F – 292), der amplificerer et 357 bp-fragment inden for genet, der koder for det vigtigste capsidprotein, VP1, som beskrevet af Oberste et al. Efter 30 cyklusser med denaturering ved 95ºC / 2”, annealing ved 42ºC / 4” og extension ved 60ºC / 3” i en GeneAmp® PCR System 9700 termocycler (Applied Biosystems) blev produkterne analyseret ved elektroforese i en 1% agarosegel indeholdende ethidiumbromid (0,5 mg/mL), med 50 bp ladder (Invitrogen) som molekylvægtmarkør og visualiseret i en transiluminator (UV-lys). Specifikke produkter blev gelrenset ved hjælp af QIAquick® Gel Extraction” (Qiagen)-kit og derefter kvantificeret ved sammenligning i 1 % agarosegel med en molekylmasse-markør med lav DNA-masseledder (Invitrogen).
Cykel-sekventeringsreaktioner blev udført ved hjælp af ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied-Biosystems) i en GeneAmp® termocycler med cyklusser på 1” ved 95ºC, 3” ved 42ºC og 3′ ved 60ºC. De sekvensprodukter, der blev opnået ved hjælp af begge primere (222 og 292) i individuelle reaktioner, blev oprenset ved udfældning med isopropylalkohol og analyseret ved hjælp af ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Enterovirus-serotyperne blev fundet ved at sammenligne sekvenserne med dem, der findes i GenBank, ved hjælp af programmet Blast .
Endemisk diagramkonstruktion og statistisk analyse
Alle data fra patientjournalerne og fra RJSHD blev indsat og analyseret ved hjælp af statistiksoftwaren SPSS, version 13.0 til Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Der blev udført beskrivende statistiske værktøjer (gennemsnit, median og standardafvigelse). Den årlige forekomst af aseptisk meningitis blev vurderet ved hjælp af befolkningsdata fra 2007-skøn fra det brasilianske institut for geografi og statistik (IBGE) som nævner.
Med henblik på opbygning af AM-endemisk diagram i Rio de Janeiro blev anmeldte tilfælde af AM analyseret mellem år 2000 og 2004. Middelværdien og standardafvigelsen af hyppighedsfordelingen af tilfælde for hver måned i året blev beregnet, hvorefter den blev lagt til hver måneds middelværdi og dens SD multipliceret med 1,96 (z for en normalfordeling med 95 % følsomhed) for at konstruere den øvre grænse i diagrammet, som repræsenterede den epidemiske tærskelværdi.
Etik
Denne undersøgelse blev projekteret i overensstemmelse med brasilianske love om forskning, der involverer mennesker, og blev godkendt af den etiske komité for Evandro Chagas Clinical Research Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro.
Resultater
Demografiske og epidemiologiske data
I alt 573 tilfælde af aseptisk meningitis blev anmeldt i 2005 i staten Rio de Janeiro; incidensen var på 3,71 tilfælde/100.000 indbyggere. Data om alders- og kønsfordeling er vist i tabel 1. Størstedelen af tilfældene opstod hos børn mellem et og ni år; i denne aldersgruppe udgjorde mænd 60,7 % af tilfældene, mens kvinder udgjorde 39,3 %. Over denne aldersgruppe blev der ikke observeret nogen kønsovervægt.
Fallene af AM optrådte i hele den undersøgte periode og var koncentreret i Rio de Janeiro-metropolregionen. Hyppighedsfordelingen af AM-tilfælde viser en epidemisk periode mellem marts og maj måned (figur 1). Den indledende epidemiperiode startede i marts med 99 tilfælde (forventet 36 tilfælde), højdepunktet indtraf i april med 122 tilfælde (forventet 38) og afslutningen i maj med 58 tilfælde (forventet 39). I Brasilien svarer denne periode til slutningen af sommeren og begyndelsen af efteråret.
Enterovirusisolering og -identifikation
I løbet af 2005 blev 171 CSF- og fæcesprøver fra AM-tilfælde analyseret for enterovirus, antallet af prøver, der blev sendt til virusisolering, varierede i denne periode fra ingen til 85 pr. måned; af de 48 (28.0% af det samlede antal sendte prøver), som ikke var polio-enterovirus, blev echovirus 30 identificeret i 17 CSF og 5 fæces (45,8% af de positive prøver). Identifikationen af dette agens fandt udelukkende sted i den epidemiske periode, og dets gennemsnitlige isolationsrate var på 17,4 % (22/126). Ikke-sekventeret ikke-polio enterovirus blev påvist uden for udbrudsperioden i de øvrige 26 (54,2 %) CSF-prøver (figur 2).
Kliniske aspekter
Af de 22 patienter med bekræftet echovirus 30-sygdom var der kliniske data til rådighed hos otte, og CSF-analyseresultater var i alle sytten CSF-prøver. Der var en overvægt af mænd (54,5 %) med en alder varierende fra 2 til 36 år (median på 4,5 år). De mest almindelige manifestationer var hovedpine, 100,0 % (8/8), feber, 87,5 % (7/8), opkastninger, 62,5 % (5/8) og nakkestivhed, 52,5 % (5/8). CSF-analyse viste pleocytose med en median på 100 leukocytter/mm3 (32 til 325 leukocytter/mm3) med mononukleær celledominans i 64,7 % (11/17). Proteinniveauet var let forhøjet med en median på 49 mg/dL (28 til 84 mg/dL) og et median glukoseniveau på 56,5 mg/dL (43 til 92 mg/dL). Case fatality rate var nul.
Diskussion
Vores undersøgelse rapporterer det første echovirus 30-relaterede udbrud i staten Rio de Janeiro, som fandt sted i 2005, og viser dets kliniske, laboratoriemæssige og epidemiologiske aspekter. Udbruddet startede i marts og fortsatte indtil slutningen af april og vendte tilbage til det endemiske niveau i juni.
Aseptisk meningitis er et syndrom med en bred liste af mulige ætiologiske agenser, og det er stærkt underrapporteret i Brasilien; i vores omgivelser skyldes vanskelighederne med at udføre etiologisk diagnose i klinisk praksis de høje omkostninger ved testning og den tekniske ekspertise, der kræves. Ikke desto mindre har flere undersøgelser, der har undersøgt etiologierne af AM i forskellige regioner i verden i de sidste 30 år, vist, at ikke-polio enterovirus var ansvarlig for størstedelen af tilfældene, idet hyppigheden varierede fra 52 % til 92 % .
I vores undersøgelse viste køns- og aldersfordelingen af AM-tilfældene et lignende mønster som beskrevet i andre undersøgelser om sygdomme i centralnervesystemet forårsaget af enterovirus, med en mandlig overvægt og med børn fra 1 til 9 år. Årsagen til den mandlige overvægt er ukendt, men det er en hypotese, at dette køn i højere grad er udsat for de risikofaktorer, der er involveret i overførslen .
AM-tilfælde i områder med tempereret klima rapporteres at have en sæsonbestemt fordeling med et højdepunkt i forekomsten om sommeren, sandsynligvis i forbindelse med skoleferier og fritidsaktiviteter . I tropiske og subtropiske områder har tilfælde af AM en ensartet fordeling over hele året, som det fremgår af det endemiske diagram, der er konstrueret i vores undersøgelse. I en tidligere undersøgelse viste dos Santos et al. et lignende mønster, men der var en tendens til at forekomme tilfælde i perioder med højere temperaturer.
Echovirus 30 har et epidemisk mønster for forekomst, og AM er det mest almindeligt rapporterede syndrom . Denne serotype har i de foregående år været ansvarlig for udbrud af AM i flere brasilianske stater (Paraná, Rio Grande do Sul, Pernambuco og Pará), altid med godartet klinisk forløb og resultat . I andre regioner i verden er echovirus 30 allerede den hyppigst isolerede serotype fra CSF fra patienter med AM, og overvågningsdata fra USA viser, at echovirus 30 har forårsaget store udbrud, afbrudt af perioder med stilstand . Molekylær epidemiologiske undersøgelser, der blev udført under udbruddene, viste fem forskellige genotyper af echovirus 30, hvilket er den foreslåede forklaring på denne epidemiologiske adfærd .
I staten Rio de Janeiro er der siden 2001 blevet rapporteret om cirkulation af echovirus 30 i forbindelse med sporadiske tilfælde af AM . I 2005 blev der mellem marts og maj måned observeret en stigning i antallet af anmeldte tilfælde af AM over det epidemiske niveau for denne periode. Samtidig blev echovirus 30 isoleret fra kliniske prøver, der blev sendt til Enteroviruslaboratoriet, i en andel, der lå langt over (17,4 %) den andel, der anses for normal for sporadiske tilfælde, dvs. under 10 %. Denne høje isoleringsprocent svarer til den, der blev beskrevet i forbindelse med et udbrud af echovirus 30 i Taiwan i 2001 . Disse forhold bekræfter, at der for første gang er tale om et udbrud forårsaget af echovirus 30 i denne stat.
Klinisk observerede vi et typisk meningitis-syndrom med pludseligt indsættende feber og hovedpine som de mest almindelige manifestationer. Case fatality rate var nul blandt patienterne med bekræftet echovirus 30-sygdom, hvilket viser sygdommens godartede forløb. Ikke desto mindre ville det være nødvendigt med en prospektiv neurologisk evaluering af disse tilfælde for at udelukke neurologiske følgevirkninger på lang sigt.
De overvågningsdata, der præsenteres i denne undersøgelse, repræsenterer alle anmeldte tilfælde, herunder de tilfælde, der sandsynligvis ikke er forårsaget af enterovirus, da andre forårsagende agenser ikke er ualmindelige i vores land, såsom Leptospira sp., denguevirus, Bartonella sp. og Herpes simplex-virus . Epidemiologiske data om de etiologiske agenser, der er ansvarlige for AM i Rio de Janeiro, er stort set ukendte, så det er et uløst spørgsmål, om enterovirus er virkelig involveret i tilfælde af AM i vores omgivelser. Et andet vigtigt aspekt, som vi ikke var i stand til at beskrive i dette udbrud, var sygdomsoverførselsmåden; enterovirus erhverves i langt de fleste tilfælde ved fækal-oral kontaminering, som kan være relateret til kontakt med en fælles kilde, som f.eks. mad og vand, eller ved kontakt fra person til person . Begge mekanismer kunne have været ansvarlige for udbredelsen af tilfældene i vores undersøgelse, men de metodologiske begrænsninger, der skyldes det retrospektive design, gjorde det ikke muligt at foretage denne analyse.
Echovirus 30 er forbundet med udbrud af aseptisk meningitis med et godartet udfald; en stigning i denne serotypes hyppighed i Brasilien forventes at manifestere sig med store udbrud af AM mellem perioder med stilstand. Intensivering og forbedring af AM-overvågningen er afgørende for tidlig identifikation af de sygdomsfremkaldende agenser i forbindelse med udbrud, hvilket bidrager til at undgå yderligere testning og unødvendig brug af antimikrobielle stoffer. Der er behov for flere undersøgelser for at fastslå andre sygdomsfremkaldende agenser for AM i Brasilien og for at belyse deres transmissionsmekanismer.
Anerkendelser
Til Maria de Fátima Calderaro fra RJSDH for at have leveret de epidemiologiske overvågningsdata.
1. Connolly KJ, Hammer SM. Det akutte aseptiske meningitis-syndrom. Infect Dis Clin North Am 1990;4(4):599-622.
2. Lee BE, Davies HD. Aseptisk meningitis. Curr Opin Infect Dis 2007;20(3):272-7.
3. Khetsuriani N, Lamonte-Fowlkes A, Oberst S, Pallansch MA. Overvågning af enterovirus – USA, 1970-2005. MMWR Surveill Summ 2006;55(8):1-20.
4. Dos Santos GP, Skraba I, Oliveira D, Lima AA, de Melo MM, Kmetzsch CI, et al. Enterovirusmeningitis i Brasilien, 1998-2003. J Med Virol 2006;78(1):98-104.
5. Gomes Mde L, Ferreira LL, Gomes RH, Lamarao LM, da Silveira E, Rodrigues Lda S, et al. RT-PCR til bekræftelse af echovirus 30 isoleret i Belem, Brasilien. Braz J Infect Dis 2007;11(4):403-6.
6. Brasil, Ministério da Saúde. Meningites. In: Guia de vigilância epidemiológica. Brasília; 2005. s. 541-569.
7. Dagan R, Jenista JA, Prather SL, Powell KR, Menegus MA. Viremia hos hospitalsindlagte børn med enterovirusinfektioner. J Pediatr 1985;106(3):397-401.
8. Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Flemister MR, Brown BA, Pallansch MA. Typebestemmelse af humane enterovirusser ved delvis sekventering af VP1. J Clin Microbiol 1999;37(5):1288-93.
9. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Grundlæggende værktøj til søgning efter lokale tilpasninger. J Mol Biol 1990;215(3):403-10.
10. Berlin LE, Rorabaugh ML, Heldrich F, Roberts K, Doran T, Modlin JF. Aseptisk meningitis hos spædbørn < på 2 år: diagnose og ætiologi. J Infect Dis 1993;168(4):888-92.
11. Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH, Figueiredo LT. Virale infektioner i centralnervesystemet i Brasilien. J Infect 2007;54(6):589-96.
12. Nery-Guimaraes R, Bittencourt LC, Pastor MV. . Rev Saude Publica 1981;15(4):379-94.
13. Rotbart HA. Viral meningitis. Semin Neurol 2000;20(3):277-92.
14. Center for Disease Control and Prevention (Center for sygdomskontrol og forebyggelse). Udbrud af aseptisk meningitis i forbindelse med echovirus 9 og 30 og foreløbige overvågningsrapporter om enterovirusaktivitet – USA, 2003. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2003;52(32):761-4.
15. Center for Disease Control and Prevention. Overvågning af enterovirus – USA, 1997-1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;49(40):913-6.
16. Antona D, Leveque N, Chomel JJ, Dubrou S, Levy-Bruhl D, Lina B. Overvågning af enterovirusser i Frankrig, 2000-2004. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007;26(6):403-412.
17. Oberste MS, Maher K, Kennett ML, Campbell JJ, Carpenter MS, Schnurr D, et al. Molekylær epidemiologi og genetisk diversitet af echovirus type 30 (E30): genotyper korrelerer med den tidsmæssige dynamik i forbindelse med E30-isolering. J Clin Microbiol 1999;37(12):3928-33.
18. Wang JR, Tsai HP, Huang SW, Kuo PH, Kiang D, Liu CC. Laboratoriediagnose og genetisk analyse af et echovirus 30-associeret udbrud af aseptisk meningitis i Taiwan i 2001. J Clin Microbiol 2002;40(12):4439-44.
19. Silva HR, Tavares-Neto J, Bina JC, Meyer R. . Rev Soc Bras Med Trop 2003;36(2):227-33.
20. Rotbart HA. Enterovirale infektioner i centralnervesystemet. Clin Infect Dis 1995;20(4):971-81.