Biosyntese af trans-4-hydroxyprolin ved rekombinante stammer af Corynebacterium glutamicum og Escherichia coli

Konstruktion af trans-Hyp producerende rekombinante stammer

Der er flere gener, der spekuleres som putative L-prolin 4-hydroxylase gen i databasen, herunder gener i Pseudomonas stutzeri, Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 og Dactylosporangium. sp. Ved hjælp af PCR klonede vi og opnåede de formodede gener af P4H fra P. stutzer og B. bronchiseptica RB50, kaldet p4hP og p4hB. De blev ligeret til de tilsvarende plasmider efter fordøjelsen og konverteret til henholdsvis C. glutamicum og E. coli. Længden af p4hP var 918 bps, mens p4hB var 924 bps. Disse sekvenser var 100 % identiske med de rapporterede gener i NCBI. Genet for trans-P4H fra Dactylosporangium sp. (p4hD) var blevet udtrykt i E. coli med succes og kan omdanne L-prolin med gode enzymatiske egenskaber . Længden af p4hD var 816 bps, der koder for et 272-amino-syre-polypeptid med en molekylvægt på 29 715 dalton . I denne undersøgelse blev p4hD anvendt med nogle ændringer på de nukleare baser. Den oprindelige gensekvens af p4hD blev analyseret (http://www.kazusa.or.jp/codon/), og resultaterne viste, at der var nogle sjældne kodoner for både C. glutamicum og E. coli. Det er blevet rapporteret, at sjældne kodoner er stærkt forbundet med et lavt niveau af proteinekspression . Codonoptimering til heterolog proteinekspression har ofte vist sig at kunne øge proteinekspressionen drastisk . De sjældne kodoner i p4hD-genet blev således erstattet af dem, der anvendes med høj frekvens i C. glutamicum, og GC-indholdet blev justeret fra 73 % til 61 % gennem synonym konvertering, hvilket var tæt på C. glutamicum-indholdet. Det modificerede p4hD-gen blev syntetiseret i henhold til ovenstående ændringer (Additional file 1).

Den ekspression af P4H er et af de vigtige aspekter ved opbygningen af trans-Hyp biosyntetisk vej. Figur 2 viser SDS-PAGE af trans-P4H’er udtrykt i rekombinant C. glutamicum og E. coli. Alle de rekombinante trans-P4H’er blev udtrykt som opløselige proteiner uden inklusionskroppe. Det var tydeligt, at de rekombinante trans-P4H’er i E. coli blev udtrykt i langt højere grad end dem i C. glutamicum (figur 2). Mange faktorer har indflydelse på ekspressionen af fremmede proteiner, herunder promotorer, værts-vektorsystemet og kulturbetingelser osv. Da det var den første, der udtrykte trans-P4H’er i C. glutamicum, vil mere omfattende undersøgelser såsom promotorvalg og optimering af kulturbetingelser blive overvejet i vores fremtidige arbejde.

Sammenligning af P4H-aktiviteter

Oxygenaser anvendes i vid udstrækning i industrien, da de kan katalysere den højt specifikke oxyfunktionalisering af uaktiverede C-H-bindinger under milde betingelser, især overførsel af molekylær oxygen til et substrat . P4H tilhører en familie af 2-oxosyreafhængige dioxygenaser, som er et monomer protein og udnytter de monomeriske snarere end polymere substrater . Aktiviteterne af trans-P4H’er ved hjælp af rekombinante hele celler i denne undersøgelse blev målt (tabel 1). Vores data viste, at det udtrykte proteinniveau og den enzymatiske aktivitet var højere ved 30°C. Resultaterne viste også, at plasmiderne var meget stabile, da plasmidstabiliteten af rekombinante E. coli- og C. glutamicum-stammer alle var mere end 98 % ved slutningen af fermenteringen.

De rekombinante celler med ekspression af forskellige gener viste forskellige niveauer af katalytiske aktiviteter over for L-prolin. Aktiviteten af trans-P4H udtrykt af E. coli BL21/ pET28a-p4hD var den højeste blandt alle de konstruerede rekombinante stammer. De nye klonede og udtrykte gener fra P. stutzeri og B. bronchiseptica viste også interesserede aktiviteter. Hvad angår de forskellige værtsstammer, var E. coli bedre repræsenteret end C. glutamicum, hvilket kan være relateret til det tilsvarende plasmids ydeevne. Fire L-prolinproducerende stammer af C. glutamicum blev anvendt som ekspressionsværtsstammer, og de resulterende rekombinante stammer viste forskellige enzymatiske aktiviteter. Den højeste specifikke enzymatiske aktivitet blandt C. glutamicum-stammerne var 40,7 U/mg – våd celle af C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Den specifikke enzymatiske aktivitet hos rekombinant E. coli/pET28a -p4hD var imidlertid op til 60,4 U/mg vådcelle. Væksten af de tre rekombinante E. coli-stammer var ens. Men der var en betydelig forskel mellem de rekombinante C. glutamicum-stammer. De rekombinante C. glutamicum-stammer med højere specifikke enzymatiske aktiviteter voksede mindre end de rekombinante C. glutamicum-stammer med lavere specifikke enzymatiske aktiviteter. Desuden var den enzymatiske aktivitet af E. coli BL21 /pET28a -p4hD lig med den af E. coli W1485/pWFH1 og højere end den af E. coli BL21/pET24-p4h1 af . p4hD i E. coli W1485/pWFH1 var den oprindelige i Dactylosporangium sp., mens p4hD i E. coli BL21/pET24-p4h1 var modificeret. Selv om kodonoptimeringen i denne undersøgelse blev designet til C. glutamicum, viste resultaterne, at den også var vellykket i E. coli.

Trans-Hyp-produktion i kolber

Produktionen af trans-Hyp af forskellige rekombinante C. glutamicum- og E. coli-stammer blev også vist i tabel 1. Udbyttet af trans-Hyp ved disse rekombinante stammer var afhængig af både den enzymatiske aktivitet af P4H og cellevæksten. E. coli BL21/ pET28a-p4hD havde det højeste udbytte, hvilket var sammenfaldende med dens specifikke enzymatiske aktivitet. Selv om de rekombinante E. coli-stammer voksede på samme måde i produktionsmediet, var der en betydelig forskel i produktionen af trans-Hyp, som ikke holdt det samme niveau med de specifikke enzymatiske aktiviteter. Produktionen af trans-Hyp fra rekombinante C. glutamicum-stammer var også meget mindre end produktionen fra E. coli BL21/pET28a-p4hD. Det skyldtes både den mindre ekspression af trans-P4H og den mindre cellevækst i C. glutamicum. L-prolinproduktionen af fire C. glutamicum-stammer var også mindre end 1 g/L. Der var lidt forskel på trans-Hyp-produktionen blandt de rekombinante stammer af C. glutamicum med samme gen p4hD, på trods af at nogle stammer havde bedre enzymatisk ydeevne og prolinproduktion.

Det lykkedes at anvende de rekombinante stammer til direkte at syntetisere trans-Hyp fra glukose via fermentering, da både de enzymer og prækursorer, der var nødvendige i processen, var til rådighed. De overeksprimerede fremmede trans-P4H’er katalyserede hydroxyleringen af L-prolin i trans-4-positionen, mens 2-ketoglutarat blev tilført af glukose gennem TCA-cyklus og derefter oxidativt dekarboxyleret til succinat (figur 1). Det blev rapporteret, at prolin kun blev krævet i produktionen af Hyp af rekombinant E. coli med p4h-genet. Kulstoffet i prolin, der blev tilsat under fermenteringen, blev kun omsat til aminosyrer, der blev syntetiseret fra TCA-cyklusintermediater, og ikke til glukoneogenese . Den akkumulerede Hyp var imidlertid på et relativt højt niveau selv uden tilsætning af prolin i denne undersøgelse. Det kunne forstås, at Corynebacterium havde den kraftige biosyntetiske vej for prolin . Den biosyntetiske vej for prolin er også blevet identificeret i E. coli, hvilket kan bidrage til syntesen af trans-Hyp ved rekombinante E. coli-stammer. Ændringen af prolinvejen i E. coli forbedrede udbyttet af Hyp, mens dannelsen af Hyp også kan afhjælpe feedback-hæmningen af prolin . Mængden af prolin (0-4 mM) fremmede produktionen af trans-Hyp. Kontinuerlig tilsætning af L-prolin forbedrede imidlertid ikke produktionsudbyttet væsentligt (tabel 2). I denne undersøgelse var dyrkningstiden betydeligt kortere end dem, der er rapporteret i litteraturen, hvilket kan tilskrives de forskellige anvendte medier og også indikerede, at der var et stort potentiale med optimering. Faktisk blev der produceret 2,28 g/L trans-Hyp af rekombinant E. coli uden tilsætning af L-prolin i kolber med en lille ændring af medierne, og 6,72 g/L blev opnået ved kun at supplere 4 mM L-prolin.

For yderligere at øge biosyntesen af trans-Hyp ved rekombinant C. glutamicum og E. coli bør alternative tilgange også overvejes. I E. coli bør nedbrydningen af prolin overvindes. Selv om trans-Hyp-produktionen ved hjælp af en putA-mutant af E. coli ikke blev forbedret yderligere, blev udbyttet baseret på det udnyttede prolin forbedret betydeligt. I både C. glutamicum og E. coli er ekspressionen af rekombinant P4H som en af oxygenaserne involveret i værtscellers fysiologiske metabolisme, herunder cofaktor, co-substrat og ilt. Uden en kraftig prolin-syntetisk vej i E. coli vil tilgængeligheden og transporten af substrat desuden begrænse transformationen alvorligt.