Effektiv produktion af 3-hydroxypropionsyre fra glycerol ved hjælp af metabolisk manipuleret Klebsiella pneumoniae

I produktionen af 1,3-propandiol eller 3-HP fra glycerol er mælkesyre det vigtigste biprodukt, som reducerer produktudbyttet betydeligt. Derfor er der gjort forsøg på at reducere laktatproduktionen ved at slette det gen, der koder for laktatdehydrogenase (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Da begge de reaktioner, der danner 1,3-propandiol og 3-HP, konkurrerer om deres fælles substrat 3-hydroxyaldehyd (3-HPA), begunstiger deletion af propandiol-oxidoreduktase 3-HP-produktionen (Ashok et al. 2011). Derfor blev generne ldhA og dhaT i denne undersøgelse slået ud for at øge 3-HP-produktionen.

Effekt af ldhA-mangel på 3-HP-produktion

Den ldhA-mangelfulde stamme JJQ01 blev konstrueret, og knockout af ldhA blev bekræftet, som vist i figur S2A. De rekombinante stammer Kp4(pUC18-kan-aldH) og JJQ01(pUC18-kan-aldH) blev konstrueret, og fed-batch-fermenteringer blev udført i 5-L bioreaktoren. Profilerne for cellevækst, glycerolforbrug og produktion af metabolitter er vist i fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) producerede 18,3 g/L 3-HP med et udbytte på 0,21 mol/mol på 38 timer, mens mælkesyre nåede 32,2 g/L med et højere udbytte på 0,34 mol/mol. Desuden blev der produceret 17,6 g/L 2,3-butandiol, 6,1 g/L 1,3-propandiol og 10,7 g/L eddikesyre. Dannelsen af laktat øger ikke blot omkostningerne, men også vanskelighederne ved at genvinde 3-HP, som er en isomer af laktat. Desuden er laktat en hovedinhibitor af 3-HP- og 1,3-propandiolbiosyntesen (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Mangel på ldhA eliminerede effektivt laktatdannelsen, og 3-HP-produktionen nåede 48,3 g/L med et udbytte på 0,28 mol/mol, som vist i fig. 2b. Koncentrationen og udbyttet af 3-HP i denne ldhA-manglende stamme blev forbedret med henholdsvis 1,64 gange og 33,3 % sammenlignet med Kp4(pUC18-kan-aldH)-stammen. Bortset fra den lille mængde ethanoldannelse (omkring 4 g/L) blev akkumulering af pyruvat og formiat af ldhA-mutantstammen ikke påvist, hvilket næsten ikke blev observeret i tilfælde af anvendelse af wildtypestammen.

Disse resultater viste tydeligt, at blokering af mælkesyreproduktionen i høj grad omdirigerede kulstofstrømmen til 3-HP-produktion. Glycerolassimilering gennem DhaB blev væsentligt forbedret, næsten 0,4 mol/mol glycerol blev dirigeret gennem DhaB til 3-HPA, hvilket var i overensstemmelse med andre undersøgelser (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). Reduktion af laktat kunne sænke toksiciteten for cellerne, begunstigede cellevækst og produktiviteten af 3-HP. Reduktion af laktat øgede imidlertid også dannelsen af 2,3-butandiol og 1,3-propandiol, som nåede op på henholdsvis 21,9 g/L med et udbytte på 0,13 mol/mol og 18,5 g/L med et udbytte på 0,12 mol/mol. På grund af ldhA-deletion kan overskydende NADH, der stammer fra øget 3-HP-akkumulering, fremme produktionen af 2,3-butandiol og 1,3-propandiol i stedet for laktat for at regenerere NAD+ og bevare redoxbalancen. Faktisk støttede dannelsen af ethanol også NAD+ regenerering, hvilket resulterede i højere flux fra pyruvat til ethanol end fluxen til pyruvat.

Effekt af dhaT-mangel på 3-HP-produktion

Deletion af ldhA øgede dramatisk 3-HP-produktionen, samtidig med at produktionen af 1,3-propandiol også blev øget til 18,5 g/L. Ko et al. (2017) rapporterede, at 43 g/L 3-HP og 21 g/L 1,3-propandiol blev opnået ved at reducere acetat og andre biprodukter. Selv om dannelsen af 1,3-propandiol gavner glyceroludnyttelsen ved at regenerere cofaktor, tegner den sig for en væsentlig del af glycerolkulstofstrømmen. Da 1,3-propandiol og 3-HP konkurrerer om den samme forløber 3-HPA, blev ldhA- og dhaT-dobbelt-knockout-stammen (vist i Additional file 1: Figur S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH) konstrueret for at begrænse strømmen til 1,3-propandiol. Resultaterne af fed-batch-fermentering i 5-L-reaktoren er vist i fig. 2c. Uventet resulterede samtidig ldhA- og dhaT-knockout kun i 44,5 g/L 3-HP, selv om udbyttet blev forøget til 0,32 mol/mol glycerol. Deletion af dhaT resulterede i reduceret 1,3-propandioltiter og udbytte til henholdsvis 9,9 g/L og 0,07 mol/mol. Men 1,3-propandiol blev stadig produceret i reaktionen katalyseret af YqhD og andre oxidoreduktaser (Ashok et al. 2013). Desuden blev 2,3-butandiolproduktionen sammenlignet med JJQ01(pUC18-kan-aldH) øget fra 21,9 til 23,4 g/L en smule, hvilket indikerer, at fluxen til 2,3-butandiolvejen blev øget for at forbruge det overskydende NADH, der stammer fra den ALDH-katalyserede reaktion. 1,3-propandiolsyntese spiller en nøglerolle i reguleringen af redoxbalancen i K. pneumoniae. Inden for oxidationsvejen producerer dannelsen af et molekyle acetat fra glycerol tre molekyler NADH, samtidig med at der dannes et molekyle ATP. Derfor reducerede deletion af både ldhA og dhaT i høj grad evnen til NAD+ regenerering, og mere NADH blev oxideret gennem 2,3-butandioldannelse, hvilket resulterede i øget 2,3-butandiol. Reduktion af beluftningshastigheden (begrænsning af ilttilførslen) kunne øge acetatproduktionen for at give mere ATP, men samtidig blev der dannet mere NADH, hvilket resulterede i yderligere øget 2,3-butandiolproduktion. Det regenererede NAD+ syntes dog at være mindre end det, der blev dannet i den reaktion, der katalyseres af DhaT, hvilket førte til lavere 3-HP-produktion. Derfor er tilførsel af en passende mængde ilt til at generere NAD+ uden at påvirke DhaB-aktivitet og glycerol dissimilation afgørende for 3-HP-produktion i mikro-aerob fermentering.

I denne undersøgelse er det ikke lykkedes at forbedre 3-HP ved at slette dhaT-genet. Glycerol dissimilation reguleres af glycerol dehydrogenase DhaD, glycerol kinase GlpK, glycerol dehydratase DhaB og 1,3-propanediol oxidoreduktaser 1,3-PDORs. Glycerolforgreningspunktets stivhed indebærer, at det er vanskeligt at forbedre 3-HP-produktionen ved at slette gener, der er involveret i fordelingen af glycerolstrømmene. Ashok et al. (2011) havde bestemt de iboende aktiviteter af DhaD, DhaB, ALDH og 1,3-PDORs efter sletning af dhaT-genet. De fandt, at aktiviteten af DhaD blev en smule forbedret, aktiviteten af ALDH faldt en smule, og aktiviteten af DhaB faldt betydeligt. Zhang et al. (2008) analyserede også robustheden ved forgreningsstederne i glycerolopløsningsvejen. Det blev vist, at fordelingen af kulstofstrømmen mellem den reduktive og den oxidative gren var robust over for miljømæssige forhold.

Effekt af beluftning på 3-HP-produktion

Vores tidligere undersøgelser viste, at mikro-aerobe forhold var gunstige for 3-HP-produktion. Sammenlignet med den anaerobe proces blev 3-HP-produktionen i den mikro-aerobe fermentering væsentligt forbedret på grund af et højere ekspressionsniveau af aldehyddehydrogenase, og samtidig blev 1,3-propandiolproduktionen reduceret (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) rapporterede, at den specifikke aktivitet af glyceroldehydratase i K. pneumoniae ved en beluftningshastighed på 0,04 vvm var 59 % højere end i fravær af lufttilførsel. Men det er blevet rapporteret, at glyceroldehydratase hurtigt kan inaktiveres af ilt (Toraya 2000; Ruch og Lin 1975), og det påvirkede 3-HP-produktionen betydeligt (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Desuden syntetiseres coenzym B12, cofaktoren for DhaB, ikke i tilstrækkelig grad under høje luftningsbetingelser i de fleste naturlige 3-HPA-producenter såsom K. pneumoniae. Huang et al. (2013) og Ko et al. (2017) viste også, at meget aerobe forhold ikke var gavnlige for 3-HP-produktion. Derfor foretog vi indledende fed-batch-eksperimenter under forskellige beluftningsforhold og fandt også, at opretholdelse af en høj beluftningshastighed var ugunstig for 3-HP-produktion efter ophør af cellevækst (data ikke vist). I fed-batch-kultur af JJQ02(pUC18-kan-aldH) vedtog vi en beluftningshastighed på halvdelen af den oprindelige hastighed, da OD650 blev lukket til den maksimale værdi. Profilerne for vækst, glycerol og metabolitter er vist i fig. 3, og den sorte pil angav det tidspunkt, hvor beluftningshastigheden skulle sænkes (0,5 vvm).

Den endelige titer af 3-HP nåede 61.9 g/L med et udbytte på 0,58 mol/mol i 5-L-reaktoren i 38 timer. 3-HP-koncentrationen og udbyttet ved JJQ02(pUC18-kan-aldH) var 3,3- og 2,76-dobbelt så højt som ved Kp4 (pUC18-kan-aldH) og 1,28- og 2,07-dobbelt så højt som ved JJQ01(pUC18-kan-aldH). Resultaterne viste, at produktionen af både 1,3-propandiol og 2,3-butandiol stoppede efter 20 timer. Titerne af 3-HP blev dog ved med at stige, selv om produktionshastigheden faldt fra dette tidspunkt. I den senere del af den mikroaerobe fermentering kunne der stadig regenereres en del NADH gennem elektrontransportkæden, selv om der kun blev regenereret lidt NADH gennem dannelsen af 1,3-propandiol og 2,3-butandiol, fordi den mest effektive måde at regenerere NAD+ på er via elektrontransportkæden i nærvær af ilt (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), hvilket resulterede i en stigning i 3-HP uden indlysende stigning i 1,3-propandiol og 2,3-butandiol.

300-L opskalering af fermentering

For at undersøge gennemførligheden af stamme JJQ02(pUC18-kan-aldH) til 3-HP-produktion i en større bioreaktor blev fed-batch fermentering udført i en 300-L bioreaktor efter de fermenteringsbetingelser, der blev etableret i 5-L fermentoren. Der blev anvendt en totrinsbeluftningsstrategi; beluftningshastigheden blev sænket til halvdelen i det tidspunkt, hvor den sorte pil er vist i fig. 4. 3-HP opnåede 54,5 g/L med et udbytte på 0,43 mol/mol, og koncentrationen og udbyttet var 12,2 g/L og 0,11 mol/mol for 1,3-propandiol, 21,3 g/L og 0,11 mol/mol for 1,3-propandiol, 21,3 g/L og 0,11 mol/mol for 1,3-propandiol og 0,3 mol/mol for 1,3-propanediol.17 mol/mol for 2,3-butandiol og 9,3 g/L og 0,11 mol/mol for acetat i 51 timer (fig. 4).

Sammenlignet med de resultater, der blev opnået i 5-L-reaktoren, blev titer og molært udbytte af 2,3-butandiol i 300-L-reaktoren tydeligvis forøget, hvilket svarede til resultaterne med den samme stamme i 5-L-reaktoren ved en konstant beluftningshastighed på 1 vvm. Det indebar, at iltoverførslen i 300-L-reaktoren kan være noget højere end i 5-L-reaktoren med reduceret beluftningshastighed, fordi nogle undersøgelser har vist, at produktion af 2,3-butandiol kræver passende beluftningshastighed (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Under beluftningsbetingelsen i 300-L-reaktoren fremmede ekspressionen af enzymer relateret til 2,3-butandioldannelse og NADH-puljen eller NADH/NAD+-forholdet 2,3-butandiolproduktionen, og ekspressionen af DhaB og AldH kunne blive påvirket en smule.

Med henblik på redoxbalance blev NADH, der blev dannet i ldhA dhaT-dobbeltmutantstammen i den reaktion, der katalyseres af ALDH, delvist regenereret gennem dannelsen af 2,3-butandiol og andre reducerede metabolitter såsom ethanol og succinat, og delvist af elektrontransportkæden (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Beluftningshastigheden i mikrobeluftningsfermenteringen havde derfor en betydelig indflydelse på slutprodukterne. Ved fermentering i 300-L-reaktoren, selv om beluftningshastigheden blev reduceret til halvdelen af den oprindelige, kan iltoverførselssituationen stadig være meget forskellig fra den i 5-L-reaktoren på grund af de forskellige iltoverførselsegenskaber, hvilket var et traditionelt emne i opskalering af bioprocesser. Forskellene i produktfordelingen i de forskellige reaktorer viste, at det er vigtigt med en præcis styring af ilttilførslen, mens en reduktion af beluftningshastigheden alene syntes at være for grov. Selv om 3-HP-titeren og udbyttet afveg en smule fra dem i 5-L-reaktoren, var opskaleringen dog vellykket. Da iltoverførselens ydeevne i 300-L-reaktoren var anderledes end i 5-L-reaktoren, forventedes det, at en yderligere præcis regulering af beluftningshastigheden i 300-L-reaktoren kunne forbedre 3-HP-niveauet.