En RNA-producerende DNA-hydrogel som platform for et højtydende RNA-interferencesystem

Syntese og karakterisering af I-gelen

De fire oligonukleotider af X-DNA (X01-X04 DNA-strenge) blev syntetiseret kommercielt af Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). X-DNA-sekvenserne (Supplerende tabel 5) blev designet, fremstillet og karakteriseret ved at følge de samme procedurer som beskrevet i litteraturen med mindre ændringer10,13. Lyofiliserede DNA-strenge i 1 μmol-skala blev opsamlet ved centrifugering ved 14 000 g i 15 s ved stuetemperatur. Hver DNA-streng blev resuspenderet til en koncentration på 1,0 mM i 1x TE-buffer (pH 8,0). Hvert rør blev rystet og blandet ved hjælp af MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) ved 1500 rpm i ~3 timer for at opløse de lyofiliserede oligonukleotider fuldstændigt. I alt blev 0,05 μmol (50 μl) af hver DNA-streng samlet i et 1,5 ml-rør, og nucleasefrit vand blev tilsat med det samlede volumen af oligonukleotidblandingen til 500 μl. 100 μl af oligonukleotidblandingen blev fordelt på 0,5 ml-rør. Rørene blev anbragt i en termocycler (Bio-Rad, CA, USA). De fire typer oligonukleotider (X01 ~04) blev annealeret under følgende betingelser: indledende denaturering ved 95 °C i 10 min; og 65 °C i 2 min, 60 °C i 5,5 min, nedsættelse med 1 °C og opretholdelse af 1 min ved denne temperatur, 20 °C i 30 s og nedsættelse til 4 °C til stabilisering og opbevaring af X-DNA. Til bufferudveksling blev den annealerede X-DNA-opløsning (500 μl) i en filterenhed (3 kDa Mw cutoff) til mikrocentrifugering centrifugeret i 6 timer ved 15 000 g og 4 °C for at reducere opløsningsmiddelvolumenet. Filterenheden blev overført til et nyt centrifugerør. I alt blev der tilsat 100 μl nukleasefrit vand ved 4 °C til filterenheden. Filterenheden blev centrifugeret i 4 timer ved 15 000 g og 4 °C for at skylle X-DNA for resterende salte. Det afskårne filtermodul anbringes med hovedet nedad i røret og centrifugeres ved 2 000 g i 3 min. ved 4 °C. Der blev tilsat nukleasefrit vand og centrifugeret yderligere to gange med det samme centrifugeringsrør for at fjerne restsalt af X-DNA fuldstændigt. Det endelige volumen af X-DNA-opløsningen vil være ~300 μl. SiRNA-ekspressionsplasmidet (I-plasmid) blev købt og maxi-præpareret af Cosmo Genetech (Seoul, Sydkorea). For at konstruere I-plasmiderne blev I-plasmiderne lineariseret ved hjælp af restriktionsenzymet BamHI. Størrelsen af siRNA-genet var 66 bp med spaceren (eller 498 bp med T7-promotoren) (se supplerende figur 4 for I-plasmidkortet). Prøvernes DNA-mængder blev bestemt ud fra deres UV/Vis-absorptionsværdi ved hjælp af et BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). X-DNA og lineære plasmider blev først blandet i et forudbestemt molforhold i tilstedeværelse af T4 DNA-ligase (Promega, Madison, WI, USA) for at syntetisere Dgelen. For et X-DNA:I-plasmid-forhold på 1500:1 anvendte vi 10,5 μL af 75 μM X-DNA og 5,25 μL af 100 nM plasmid i et reaktionsvolumen på 30 μL. Til Blank-gel-eksperimentet blev den samme mængde X-DNA-materiale som i I-gelen ligeret med T4-DNA-ligase. 10 µL af hver prøve blev blandet med 2 µL gel loading buffer og elektroforeset på en 0,7- eller 2 % agarosegel ved 100 V i 60 minutter. Alle DNA’er (X-DNA, I-plasmid, Blank-gel og I-gel) blev bekræftet ved agarosegelelektroforese (supplerende figurer 3, 11 og 18). De syntetiserede D-geler blev afsaltet to gange ved hjælp af Amicon 3-kDa Mw cutoff mikrotubulære centrifugalfiltre. Til scanningelektronmikroskopi (SEM) blev prøverne frysetørret i en FreeZone frysetørrer (Labconco, Kansas City, MO, USA), indtil alt vand var blevet fjernet. De tørrede prøver blev knækket for at afsløre deres friske overflader. Efter at være blevet sputterbelagt med et 2~ 3-nm Pt-lag i 100 s blev morfologierne af disse hydrogeloverflader observeret ved ~50.000× forstørrelse ved hjælp af et S-3500N (Hitachi, Tokyo, Japan) scanningelektronmikroskop ved en accelerationsspænding på 15 kV (Supplerende figur 19).

I-gel stabilitetstest

Syv prøver blev fremstillet for hver af det frie I-plasmid og I-gelen. I hver prøve blev 2 µL af det frie I-plasmid (57 ng) eller I-gel (1:1500 gel indeholdende 57 ng I-plasmid) fortyndet i 12 µL destilleret vand, hvorefter 4 µL transkription optimeret 5 × buffer blev tilsat og behandlet med 3,33 × 10-5 enheder af DNase I (nr. M6101; Promega) til 20 µL slutvolumen, efterfulgt af inkubation ved 37 °C i henholdsvis 0, 1, 4, 12, 24 og 48 timer. Efter inkubationen blev prøverne på 20 µL adskilt i to alikvater på 10 µL, en til elektroforese og en anden til efterfølgende transskription. I hver alikvot blev denatureringsreaktionen afsluttet ved tilsætning af 1 µL RQ1 DNase-stopopopløsning og inkubation i 10 min. ved 65 °C. Derefter blev 10 µL af hver prøve blandet med 2 µL gel loading buffer og elektroforeset på en 2% agarosegel ved 100 V i 60 min (supplerende figur 13). En anden alikvot af hver prøve blev anvendt til transkriptionsreaktion for at demonstrere transkriptionseffektiviteten af I-gel efter fordøjelsesreaktionen. shRNA’er blev transskriberet fra I-gel- eller frie I-plasmid-skabeloner (0, 24, 48 timer) ved hjælp af transkriptionssæt (Riboprobe; Promega) efter producentens anvisning. De opnåede shRNA’er blev kvantificeret ved RT-qPCR som beskrevet i afsnittene Forberedelse af total RNA og omvendt transskription og Real-time PCR og dataanalyse (Supplerende tabel 4).

Ekspressions- og inhiberingsanalyser af proteiner

Koblede transkriptions- og translationssæt (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, katalog nr. 88882) blev købt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), og reaktionerne blev udført ved at følge de procedurer, der er foreslået af producenten. Kort fortalt blev HeLa cellelysat, accessoriske proteiner, reaktionsblanding og pcDNA3.1( + ) IRES GFP plasmid (0,5 μg/μL; nr. 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) blandet i en 12,5:2.5:5:5:2 (v/v) forholdet og inkuberedes ved 30 °C i 1, 2, 4 og 6 h. Efter de angivne reaktionstider blev prøveopløsningerne inkuberet i 24 h ved 4 °C for både at stoppe reaktionen og sikre tilstrækkelig tid til proteinfoldning. For at vurdere interferensvirkningen blev frit I-plasmid eller I-gel tilsat cellelysatet i tilstedeværelse af 1000 ng GFP-plasmid. I kontrolforsøgene for den optimerede I-gel tilstand indeholdende 57 ng I-plasmid (17,5 nmol), scrambled shRNA (17,5 nmol og 1,75 μmol; henholdsvis 1 eq og 100 eq til mængden af I-plasmid) (SN-1003; Bioneer, Seoul, Korea), scrambled plasmidblanding (17.5 nmol; scrambled shRNA-ekspressionsplasmidblanding; Cosmo Genetech), scrambled plasmidgel (scrambled plasmidblanding enzymatisk tværbundet med X-DNA), I-gelkomponenten (kun X-DNA, kun I-plasmid eller disse blandinger uden enzymatisk tværbinding; dvs. ingen geldannelse) eller Blank-gel (kun enzymatisk tværbinding af X-DNA’er) blev tilsat direkte til GFP-ekspressionsreaktionsopløsningen. Alle reaktioner blev udført mindst tre gange. Medmindre andet er angivet, blev reaktionsvolumenet holdt på 25 μL. Fluorescensspektrene blev analyseret ved hjælp af et spektrofluorofotometer (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seoul, Korea) til bestemmelse af niveauet af GFP-ekspression i cellelysatopløsningen.

Total RNA-fremstilling og omvendt transskription

Som en spike-in-kontrol blev 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL; nr. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada) tilsat til alle de præeksponerede cellelysater (20 µL) før RNA-ekstraktion. Derefter blev total RNA ekstraheret fra 23 µL af lysatet ved hjælp af TRIzol-reagenset (Ambion, Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens anvisninger. Det ekstraherede totale RNA blev opløst i 10 µL DEPC-behandlet vand (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Derefter blev 2 µL total RNA polyadenyleret med 1 mM ATP i 1 × poly(A)-polymerasebuffer indeholdende 5 U Escherichia coli-poly(A)-polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) ved 37 °C i 30 minutter i en 20 µL reaktionsblanding. Til omvendt transskription blev 4 µL af det svansede RNA blandet med 1 pmol RT-primer og 0,5 mM dNTP-blanding og derefter suppleret op til et volumen på 13 µL med DEPC-behandlet vand. Blandingen blev opvarmet ved 65 °C i 5 minutter og derefter hurtigt afkølet på is. Reaktionsblandingen blev derefter suppleret til et slutvolumen på 20 µL ved tilsætning af 5 mM dithiothreitol, 1 × første-strengsbuffer, 40 U RNaseinhibitor og 200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og inkuberet ved 50 °C i 1 time, efterfulgt af enzyminaktivering ved 70 °C i 15 minutter. RT-primersekvenserne (se supplerende tabel 5) blev designet til syntese af cDNA fra RNA-sekvensen. Den anvendte primer var 3′ RACE-adapteren, som er indeholdt i FirstChoice RLM-RACE-kittet (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Alle primere blev syntetiseret af Cosmo Genetech, undtagen cel-miR-39 forward-primeren (Norgen Biotek Corp.). Genfindingsgraden af RNA i hver lysatopløsning blev vurderet ud fra forskellen mellem CT-værdien af den opnåede spike-in-kontrol og referencen cel-miR-39 (ikke videreført med ekstraktionsprocessen).

Real-time PCR og dataanalyse

Mængderne af shRNA og GFP mRNA blev kvantificeret ved qPCR ved hjælp af StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qPCR af hver prøve blev udført i et samlet volumen på 20 µL med 2 µL cDNA, 10 µL af 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) og 10 pmol af hver primer. Amplifikationen blev udført under følgende betingelser: indledende denaturering ved 95 °C i 10 min. og 30 cyklusser på 95 °C i 15 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 30 s. qPCR blev også udført med cel-miR-39 som reference-RNA for at opnå genfindingsgraden af total RNA i hver prøve. qPCR-protokollen var den samme som den, der er beskrevet ovenfor i dette afsnit, bortset fra de anvendte primere, som var 10 pmol af en fælles omvendt primer (den samme som den omvendte shRNA-primer) og cel-miR-39 fremadrettet primer. Smeltningskurven for hvert amplificeret DNA-produkt blev opnået ved at måle fluorescensintensitetsændringen af SYBR Green-farvestoffet seks gange pr. prøve, mens temperaturen øgedes fra 60 °C til 95 °C med en hastighed på + 0,3 °C/s efter afslutningen af qPCR’en. De specifikke primere til qPCR blev designet ved hjælp af Primer3-programmet (http://primer3.ut.ee/) (Supplerende tabel 5). Den relative ekspression af målene blev bestemt ved hjælp af den sammenlignende 2-ΔΔΔCT-metode. Den relative mængde GFP mRNA blev også bekræftet ved hjælp af måling af båndintensiteten på 2 % agarosegel. Amplifikation af cDNA’et blev udført med de samme PCR-betingelser og det samme program som anvendt til qPCR beskrevet ovenfor, bortset fra PCR-cyklusantallet (20 for GFP mRNA).

Kalibrering og kvantificering af den absolutte RNA-mængde

Standardkurver for RNA-koncentrationen og CT-værdien blev opnået ved at anvende hvert RNA-standardmateriale. For shRNA blev standardkurven opnået ved at anvende syntetiserede shRNA’er købt hos Integrated DNA Technologies. For GFP mRNA blev kurven fremstillet ved hjælp af GFP mRNA ekstraheret fra et transkriptionssæt (Riboprobe; Promega) i overensstemmelse med producentens anvisninger. RNA-mængden af standard shRNA’et blev oplyst af Integrated DNA Technologies, mens mængden af det ekstraherede standard GFP mRNA blev bestemt ud fra dets UV/Vis-absorptionsværdi ved hjælp af BioSpectrometeretret. De opnåede standard-RNA’er blev omdannet til cDNA ved omvendt transskription som beskrevet ovenfor i afsnittet “Fremstilling af total RNA og omvendt transskription”. Derefter blev cDNA’et fortyndet 10, 100, 1000 og 10 000 gange, hvorefter qPCR blev gentaget tre gange, og de opnåede CT-værdier blev anvendt til at opnå en standardkurve. De CT-værdier, der blev opnået fra RT-qPCR, blev omregnet til de oprindelige RNA-koncentrationer i cellelysaterne ved hjælp af en kalibreringsproces (supplerende figur 6). Den endelige absolutte RNA-mængde blev bestemt ved at multiplicere hver RNA-genoprettelsesgrad (%) og værdien af RNA-mængden fra kalibreringskurven (supplerende tabeller 1 og 2).

Cellulær mærkning med Cy5-I-gel

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler blev opnået fra Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea) og opretholdt i DMEM suppleret med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin-streptomycin i et fugtigt og CO2 (5%)-vedligeholdt inkubator. MDCK-celler, der udtrykker GFP (MDCK-GFP), blev fremstillet ved at transficere pEGFP-N1-vektor i cellerne ved hjælp af Lipofectamine-reagenser (Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens protokol. Herefter sorterede vi de GFP-emitterende celler ved hjælp af FACSCanto II-systemet (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Under hele undersøgelsen blev cellerne testet negative for mycoplasmaforurening. Dyrkede MDCK-GFP-celler i 24-hulsplader med dækglas (50.000 celler pr. brønd) blev sammenkoblet med Cy5-I-gel (Cy5-konjugeret I-gel) indeholdende Cy5-konjugerede X01 DNA-sekvensstrenge (svarende til 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) i serumfrit medium i 4 timer. Til fremstilling af Cy5-I-plasmidet blev Cy5-dsDNA (Cy5-konjugeret dsDNA) først fremstillet ved annealing af Cy5-konjugeret X01 (med en ekstra 5′-p-GATC-klæbende ende) og dets komplementære modstreng (5′-CGA GTA GGT ACG GAT GAT CTG ACC ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Derefter blev Cy5-dsDNA og I-plasmidet blandet og ligeret i et molforhold på 5000:1. Overskydende ubundet Cy5-dsDNA blev fjernet ved centrifugering (12 400 g, 4 °C, 60 min) ved hjælp af Amicon mikrotubulære centrifugalfiltre (50 kDa Mw cutoff) i 4-5 gange. Cy5-shRNA (Cy5-konjugeret shRNA) blev syntetiseret kommercielt (Integrated DNA Technologies). For Cy5-I-plasmid- og Cy5-shRNA-sættene blev cellerne sammenkoblet med 2,625 nM af hver prøve i serumfrit medium i 4 timer. For Lipofectamine-Cy5-I-plasmid- og Lipofectamine-Cy5-shRNA-sættene blev Lipofectamine og den Cy5-konjugerede prøve elektrostatisk komplekseret ved at blande dem sammen i et molforhold på 1:1 til en endelig opløsningskoncentration på 2,625 μM Lipofectamine og 2,625 μM substrat. Derefter blev cellerne samkoblet med 2,625 μM Lipofectamine-Cy5-I-plasmidet eller Lipofectamine-Cy5-shRNA i henholdsvis serumfrit medium i 4 timer. I tilfælde af den rene cellekontrol blev cellerne samkoblet med serumfri DMEM indeholdende 1 % (v/v) penicillin (HyClone). Efter 4 h sammenkobling blev alle prøverne vasket to gange med fosfatbufferet saltvandspuder (PBS) buffer (0,1 M, pH 7,4), og cellerne blev yderligere inkuberet i 6 h i et vækstmedium indeholdende 10% (v/v) føtal bovin serum (FBS; HyClone) og 1% penicillin for at sikre tilstrækkelig cellulær genopretning og optagelsestid. De dyrkede celler blev fikseret med 4 % formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og yderligere vasket tre gange med PBS-buffer (0,1 M, pH 7,4). Til mikroskopisk billeddannelse blev dækglas med de fasthæftede celler monteret på glasplader ved hjælp af vandigt indstøbningsmedie med et antifadingmiddel. Fluorescensbillederne blev optaget med et Zeiss Axioplan 2-mikroskop, og billederne blev taget med et Zeiss Axiocam HR-kamera.

GFP-gen-silenceringseksperiment ved hjælp af I-gel

Først blev I-gelen, der indeholdt 262,5 µM X-DNA og 175 nM I-plasmid, inkuberet med 300 U T7 RNA-polymerase (Thermo Fisher Scientific) i 15 min ved stuetemperatur. Efter inkubationen blev I-gel-prøven fortyndet til 100 gange i serumfri DMEM indeholdende 1 % penicillin. Derefter blev 1/6 gange mængden af I-gel/polymerase-komplekset tilsat til hver brønd i en 24-hulsplade med dækglas, som var blevet præplateret med MDCK-GFP-celler (20 000 celler pr. brønd) i 24 timer. For I-plasmid-, scrambled plasmid-blandingen og scrambled plasmid-gel-sættene blev MDCK-GFP-cellerne samdyrket med den samme molare mængde af hvert plasmid og T7 RNA-polymerase som i tilfældet med I-gelen. Til måling af RNAi-effekten af nøgent shRNA og Lipofectamine-shRNA blev der anvendt 100 gange mere af hver RNA-prøve i forhold til antallet af I-plasmid-skabelon, idet der blev taget hensyn til shRNA-ekspressionsraten for I-gelen som beregnet ud fra cellelysateksperimentet. For de nøgne shRNA- og scrambled shRNA-sæt blev MDCK-GFP-celler samkoblet med 175 nM af RNA-prøven. De lipofectaminkomplekse prøver blev fremstillet i henhold til producentens anvisninger. For Lipofectamine-I-plasmid- og Lipofectamine-scrambled plasmid-blandingssættene blev Lipofectamine og hver plasmidprøve elektrostatisk komplekseret ved at blande dem sammen i et molforhold på 5:1 for at opnå en endelig opløsningskoncentration på 8,75 nM Lipofectamine og 1,75 nM plasmidsubstrat. For Lipofectamine-shRNA-sættet blev Lipofectamine og frit shRNA elektrostatisk komplekseret ved at blande dem i et molforhold på 5:1 for at opnå en endelig opløsningskoncentration på 875 nM Lipofectamine og 175 nM shRNA. MDCK-GFP-cellerne blev sammenkoblet med de som forberedt Lipofectamin-komplekserede prøver i serumfrit medium i 4 timer. For det cellevise sæt blev kun MDCK-GFP-cellerne inkuberet i serumfrit medium i 4 timer uden nogen prøver. Alle prøverne blev vasket ud efter den sammenfaldende periode på 4 h, og cellerne blev desuden inkuberet i 48 h med vækstmediet (DMEM indeholdende 10 % (v/s) FBS og 1 % penicillin) for at evaluere RNA-silenceringseffekten ved 37 °C under 5 % CO2. Cellerne blev derefter fikseret med 4 % formaldehyd i 10 min. ved stuetemperatur og vasket med PBS-buffer (0,1 M, pH 7,4). Til mikroskopisk billeddannelse blev de dækglasfikserede celler monteret på glasplader ved hjælp af vandigt monteringsmedie med et antifadingmiddel.

Genekspressionsanalyse ved kvantitativ PCR i levende celler

Alle prøver blev behandlet til og inkuberet i hvert cellemedie i samme mængde og samme tilstand som anvendt i det tidligere beskrevne GFP-gen-silencing-forsøg ved hjælp af I-gel-sektionen. Efter inkubationen blev cellemediet opsuget fra cellekulturpladerne, og MDCK-GFP-cellerne blev vasket én gang med PBS-buffer og trypsiniseret for at løsne cellerne i hver brønd i pladen. De løsrevne celler blev fortyndet med PBS-buffer for at deaktivere trypsinen og blev derefter opsamlet i et 1,5 mL mikrotube og pelleteret ved centrifugering (180 g, 5 min). Supernatanten blev fjernet, og cellerne blev fortyndet med 20 µL PBS-buffer. Cellesuspensionsopløsningen (20 µL) blev behandlet med 1 mL TRIzol-reagens, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL) og 200 µL kloroformopløsning. Den efterfølgende RNA-ekstraktion blev udført i henhold til producentens anvisninger. Til kvantificering af den relative mængde GFP mRNA og shRNA på celleniveau blev alle qPCR’er af prøvepræparaterne udført efter samme metode som beskrevet i afsnittene “Samlet RNA-præparering og omvendt transskription” og “Realtids-PCR og dataanalyse”.

Cellebilledeanalyse til kvantificering af pixelintensitet

Ved behandling af cellebilledet blev data udført ved hjælp af MATLAB-programmet (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). De rå fluorescensbilleder blev importeret til MATLAB, og hver pixel i billederne blev konverteret til hver komponent i matrixen. Fordelingen af fluorescensintensiteterne for hver komponent blev grafisk repræsenteret ved hjælp af et histogram. Hele datasættet blev opdelt i 256 intervaller.

Fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse

Cellerne blev vasket én gang med 1 mL PBS efterfulgt af en sugning af vækstmediet fra cellekulturpladerne. Derefter blev cellerne løsnet fra pladen ved hjælp af trypsinbehandling. De løsrevne celler blev opsamlet i et 15-mL-rør efterfulgt af centrifugering, der resulterede i en pellet (180 g, 3 min). Den overskydende trypsinopløsning blev fjernet, og cellepelleten blev vasket to gange med 2 mL PBS. Cellerne blev resuspenderet i PBS til en koncentration på 50 000 celler/mL. Derefter blev prøverne forberedt ved at fiksere cellerne i 1 % formaldehydopløsning i 10 min. ved stuetemperatur. Prøverne blev analyseret for GFP-fluorescensintensitet ved hjælp af FACSCanto II-systemet (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Relative levedygtighedsniveauer i mørk tilstand

En MDCK-GFP-celle-suspension (5.000 celler pr. brønd) blev fordelt i en 96-hulsplade (Corning Inc., Corning, NY, USA) og inkuberet i 1 døgn ved 37 °C under 5 % CO2. Når cellerne havde sat sig fast på pladen, blev de sammenkoblet med forskellige koncentrationer af I-gelen (svarende til X-DNA-koncentrationen) i vækstmediet (DMEM indeholdende 10 % (v/v) FBS og 1 % penicillin) i mørke. I-gelen bestod af et X-DNA:I-plasmid-molforhold på 1500:1. Disse prøver blev inkuberet i 6, 24 og 48 timer ved 37 °C under 5 % CO2 i 6, 24 og 48 timer. Ved slutningen af hver inkubationstid blev Cell Counting Kit-8-opløsning (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) tilsat prøverne i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter yderligere inkubation i 1 time blev absorbansen ved 450 nm målt ved hjælp af en mikropladelæser. Resultaterne af denne måling blev udtrykt som forholdet mellem absorbansen af prøven og absorbansen af de negative kontrolceller uden prøveinkubation.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med Prism 7.05-software (GraphPad Software) til Student’s t-test, envejs ANOVA med Bonferroni posttest for flere sammenligninger. Holm-Bonferroni-posttest for flere sammenligninger blev udført ved hjælp af Bonferroni-posttestresultater for flere sammenligninger fra Prism 7.05-software (GraphPad Software)30. Normalitetstesten blev beregnet ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen. I resultaterne af Shapiro-Wilk-testen var dataene omtrent normalt fordelt. Statistisk signifikans er angivet som *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.