Fedtsyreprofiler og deres fordelingsmønstre i mikroalger: en omfattende analyse af mere end 2000 stammer fra SAG-kultursamlingen

En database over FA-profiler fra forskellige mikroalger

Karakteriseringen af FA-profiler fra SAG-mikroalgestammerne blev udført ved at screene langkædede FA’er (C-14 – C-24), der er esterificeret i lipider. I alt 2076 kulturstammer fra SAG (svarende til 91 % af SAG’s bedrift) blev screenet. Der blev oprettet en database, som indeholdt alle identificerede FA’er og nogle andre hydrofobiske metabolitter. Tabel 1 viser en oversigt over alle de stoffer, der er identificeret i de screenede algestammer. I alt 86 forskellige stoffer blev identificeret ved massespektrometri, hvoraf 76 repræsenterer methylestere af FA’er. Ud af de 76 fedtsyrer blev 36 stoffer identificeret ved hjælp af deres massespektrum og deres retentionstid i overensstemmelse med et standardstof, og de øvrige 40 fedtsyrer blev kun identificeret ved hjælp af deres massespektrum. De resterende 10 stoffer blev også kun identificeret ved hjælp af deres massespektrer. Ved sammenligninger med et standardstof blev forbindelsen identificeret ved sammenligning med massespektrer med størst lighed med det foreslåede stof i MS-biblioteket (Nist02 eller Wiley98). Herved blev nogle methylestere af forgrenede FA’er påvist, f.eks. 12-methyl-14:0 eller 3, 7, 11, 15, 15-tetramethyl-16:0. Mens der for de fleste FAME’er var autentiske standarder eller MS-referencer til rådighed, var det for nogle andre stoffer kun muligt at identificere dem efter “best hit”-metoden. DMOX-derivaterne gjorde det muligt at identificere de resterende 12 FAME’er. Uidentificerede stoffer er endnu ikke blevet verificeret med autentiske standarder, som ikke er tilgængelige på nuværende tidspunkt. Den komplette database er vist som supplerende fil 1.

Bakterier i algekulturer (som forurening eller nogle gange endda gennem symbiose) er velkendte og kan findes i kulturstammer i næsten alle algekultursamlinger. Kun en lille brøkdel (ca. 20 %) af de undersøgte SAG-stammer kan være i axenisk tilstand. Derfor kan også FA-indholdet i de kontaminerende bakterier have bidraget til den opnåede FA-profil. For at teste dette målte vi methyl-15:0 og methyl-17:0, der betragtes som markører for bakterieforurening . Kun 34 stammer ud af de 2076 analyserede stammer indeholdt små mængder methyl-15:0. Denne observerede lave forekomst af kontaminerende bakterier blev understøttet af mikroskopiske kontroller, som er rutine i den løbende vedligeholdelse af algestammer (data ikke vist). Sammenfattende konkluderer vi, at kun 1-2% af stammerne kan have været kontamineret, og at der kun er en mindre indflydelse af bakteriekontamineringer på de observerede FA-profiler fra algekulturer.

Dertil kommer, at vi sammenlignede de målte FA-profiler for 10 tilfældigt udvalgte stammer fra forskellige klasser med offentliggjorte data (tabel 2), og det skal bemærkes, at kun én ud af de 10 stammer, der blev udvalgt fra de offentliggjorte data, stammede fra SAG-samlingen. For 6 stammer var FA-profilerne meget ens. For de 4 resterende stammer blev der observeret store forskelle i graden af desaturering af FA’er med forskellige kædelængder, hvilket kan forklares ved de forskellige dyrkningsbetingelser, der er anvendt i de forskellige undersøgelser.

Mønstre for fedtsyresammensætning

FAME-profilerne var ret forskellige blandt stammerne. Som et eksempel er FAME-profiler fra fire forskellige slægter, nemlig Chroococcus (Cyanobacteria), Closteriopsis (Chlorophyta, Trebouxiophyceae), Pseudochantransia (Rhodophyta) og Prymnesium (Chromalveolates, Haptophyta), præsenteret i figur 1. Det var derfor forventet, at der kunne genfindes visse forskellige FA-fordelingsmønstre mellem fylaer, klasser og slægter af mikroalger. Desuden blev det testet, om der også kan findes forskelle i FA-mønstre for grupper af lavere taksonomisk rang, dvs. mellem arter af samme slægt eller endog mellem flere isolater af samme art.

2.1 Fordeling af fire vigtige PUFA’er blandt stammer fra SAG’s algekultursamling

Fordelingsmønstrene for FA’er blandt og inden for de 17 grupper (fyler eller klasser) af mikroalger og cyanobakterier, som de undersøgte stammer omfatter, blev undersøgt mere detaljeret for fire PUFA’er, som er af stor ernæringsmæssig interesse (tabel 3). Forekomsten af disse fire PUFA’er i en bestemt gruppe af mikroalger er angivet som procentdelen af stammer med en bestemt FA i forhold til alle undersøgte stammer i tabel 3.

Da SAG’s kultursamling fokuserer på mikroskopiske alger fra terrestriske levesteder, var Haptophyta, Dinophyta og Phaeophyceae kun svagt repræsenteret. Derfor er de genfundne fordelingsmønstre i disse og andre dårligt repræsenterede grupper måske ikke repræsentative for hele gruppen. For Phaeophyceae var der f.eks. hovedsagelig mikroskopiske former (f.eks. Ectocarpus og ferskvandsslægten Bodanella) til rådighed, og de undersøgte Rhodophyta-stammer omfattede hovedsagelig ferskvandsformer eller former fra terrestriske habitater (f.eks. Porphyridium). Selv om kiselalger er meget forskellige i terrestriske habitater, repræsenterer den undersøgte lille stikprøve af tilgængelige kiselalgestammer (18) langt fra denne gruppe, som sandsynligvis er den mest artsrige algegruppe, på passende vis. For hver af de to klasser af Stramenopiles (heterokontalger), Phaeothamniophyceae og Raphidophyceae, findes der kun to stammer i SAG, og de behandles derfor ikke yderligere her. Tilsvarende er der kun en enkelt stamme af Chlorarachniophyta (Rhizaria-supergruppen) i SAG.

Den meget langkædede PUFA docosahexaensyre (DHA, 22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) var den tredje hyppigste FA, der var til stede i 15 ud af 20 undersøgte grupper (tabel 3). I Dinophyta, Haptophyta og Euglenoiderne var DHA-holdige stammer særligt hyppige, og DHA fandtes der i relativt høje procentdele af det samlede FA-indhold, dvs. i 60 % eller mere af disse stammer var DHA-andelen højere end 5 %. I den eneste undersøgte dinofytstamme af Ceratium horridum var DHA-andelen endda 29,3 %. I de andre grupper blev DHA fundet i ret lave frekvenser og også for det meste i ret små andele, dvs. mindre end 1 % af det samlede FA-indhold. Selv om DHA blev fundet i Cryptophyta og Bacillariophyceae i ca. hver femte stamme, var dens andel af det samlede FA-indhold der mindre end 5 %, undtagen i Cryptomonas baltica SAG 18.80 (Cryptophyta), hvor den var 13,7 %. På trods af at DHA blev fundet i ret lave frekvenser i grønalgerne (Chlorophyta), blev det næsthøjeste DHA-indhold af alle SAG-stammer, 18,9 % af den samlede FA, fundet i chlorofyten Chlorococcum novae-angliae SAG 5.85, efterfulgt af trebouxiofyten Prototheca zopfii SAG 263-8 med 14,2 %. Tilsammen er disse resultater i overensstemmelse med de DHA-mængder, der tidligere er beskrevet for specifikke algegrupper.

Eicosapentaensyre (EPA, 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 14Z, 17Z)) var en af de mest almindelige PUFA’er, der blev fundet i alle de 17 grupper, der var omfattet af vores undersøgelse (tabel 3). Stammer, der indeholdt EPA, var særligt hyppige i Eustigmatophyceae, Glaucophyta, Xanthophyceae og Rhodophyta. De højeste EPA-andele af det samlede FA-indhold fandtes i Rhodophyta, hvor ca. 81 % af stammerne indeholdt mere end 10 % EPA. De højeste værdier var 52,4 % hos Compsopogonopsis leptoclados SAG 106.79 og 44,9 % hos Acrochaetium virgatulum SAG 1.81. Også stammer af tre arter af Porphyridium indeholdt store mængder EPA (31,2 % i P. sordidum SAG O 500, 27,5 % i P. aerugineum SAG 110.79 og 26,7 % i P. purpureum SAG 1380-1a). Dette er i overensstemmelse med en rapport om P. cruentum, der tyder på, at rødalger er en rig kilde til EPA . Selv om EPA blev fundet ret hyppigt i Glaucophyta, var det kun omkring halvdelen af alle stammer, der havde en EPA-andel på over 10 % (maksimum 31,1 % i Glaucocystis nostochinearum SAG 28.80). Dette stemmer overens med en anden undersøgelse, som viste store mængder EPA (ud over ARA) i glaucofyten Cyanophora paradoxa . Den højeste procentdel (87 %) af stammer med en EPA-andel på over 10 % fandtes i Dinophyta, men med et maksimum på kun 24,3 % i Pyrocystis lunula SAG 2014. I Euglenoiderne, Xanthophyceae og Eustigmatophyceae havde ca. 67 % af alle stammer en EPA-andel på over 10 % med maksimumsværdier på ca. 31 % (31,4 % i Heterococcus fuornensis SAG 835-5, 31,6 % i Euglena proxima SAG 1224-11a) og 34,6 % i Goniochloris sculpta SAG 29.96. EPA blev sjældent fundet og for det meste i ubetydelige mængder (< 5 %) i de fleste grønalger, men tre stammer havde et usædvanligt højt indhold på omkring 20 % af de samlede FA’er (24,2 %, Chlorella sp. SAG 242.80; 24,0 %, Chlamydomonas allensworthii SAG 28.98; 22,3 %, Cylindrocapsa involuta SAG 314-1). EPA var den eneste FA, der blev genfundet fra Chlorarachnion repens SAG 26.97 (Chlorarachniophyta). At Xanthophyceae og Eustigmatophyceae indeholder EPA i relativt store mængder, mens grønalger sjældent akkumulerer EPA, bekræfter tidligere undersøgelser .

Arachidonsyre (ARA, 20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) blev hyppigst fundet i Phaeophyceae, hvor den var til stede i alle stammer undtagen én undersøgt stamme (tabel 3); i ca. 54 % af alle Phaeophyceae-stammer var andelen af ARA højere end 10 %, men med et maksimum på blot 17,7 % i Halopteris filicina SAG 10,96. ARA havde den højeste andel af de samlede FA i Rhodophyta; her havde endog ca. 77 % af alle stammer et ARA-indhold på over 10 % med et maksimum på 68,3 % i Pseudochantransia sp. SAG 19.96. Det er interessant, at ARA-indholdet var ret højt, men varierede blandt de otte undersøgte multiple isolater af rhodofytten Porphyridium purpureum. Mens den gennemsnitlige ARA-andel var ca. 31 % i seks stammer, var den kun 3,8 % i SAG 1380-1d, men 44,5 % i SAG 1380-1e. Vi har endnu ingen forklaring på denne variation; begge stammer blev isoleret fra marine habitater og holdes under de samme kulturbetingelser. Der er allerede fundet høje andele af ARA (samt EPA), som er karakteristisk for en anden art af Porphyridium cruentum . ARA var til stede i omkring halvdelen af alle undersøgte Euglenoid-stammer og med relativt høje andele af det samlede FA-indhold, dvs. omkring en tredjedel af stammerne havde mere end 5 % ARA med ekstraordinært høje værdier på 41,3 % og 34,3 % i Rhabdomonas incurva SAG 1271-8 og Khawkinea quartana SAG 1204-9. Det er interessant, at en anden stamme af samme art K. quartana, SAG 1204-9, havde mindre end halvdelen (13,3 %) af ARA-indholdet, og i fem andre Rhabdomonas-arter blev der ikke fundet ARA i fem andre arter af Rhabdomonas. Dette viser, at FA-indholdet kan være ret varierende mellem arter af samme slægt og endda mellem flere isolater af samme art. Selv om omkring halvdelen af alle undersøgte stammer af Xanthophyceae og Eustigmatophyceae indeholdt ARA (tabel 3), havde de dette FA i relativt lave andele. Kun en fjerdedel af de ARA-holdige Xanthophyceae-stammer havde mere end 5 %, og hos Eustigmatophyceae-stammerne var der ingen stamme, der nåede op på 5 %. ARA blev sjældent fundet i grønalgerne, dvs. med en gennemsnitlig hyppighed på ca. 14 % i stammerne Chlorophyta og Streptophyta, undtagen for prasinofyte grønalger, hvor ARA var til stede i 42,9 % af alle stammer (tabel 3). Der var dog et par enkelte grønalgeeksempler med ekstraordinært høje ARA-indhold, dvs. 73,8 % (svarende til 102 μg/mg tørvægt, det højeste ARA-indhold, der blev påvist i alle undersøgte SAG-stammer) i klorofytten Palmodictyon varium SAG 3.92, efterfulgt af 52,9 % i klorofytten Trochisciopsis tetraspora SAG 19.95 og 51,8 % i trebouxiofytten Myrmecia bisecta SAG 2043. At der blev fundet et højt ARA-indhold i sidstnævnte stamme er i overensstemmelse med, at den er fundet nært beslægtet med Parietochloris incisa (syn. Lobosphaeropsis incisa, Myrmecia incisa) . P. incisa er blevet betegnet som en “olieholdig mikroalge” og den hidtil rigeste plantekilde til ARA på grund af dens evne til at akkumulere store mængder ARA (op til 59 % af dens samlede FA-indhold) . Interessant nok havde SAG-stammen af P. incisa (Lobosphaera incisa SAG 2007) med 13,2 % et meget lavere ARA-indhold (tabel 2).

γ-Linolensyre (GLA, 18:3(6Z, 9Z, 12Z)) var den tredje mest almindelige FA i den undersøgte prøve af SAG-mikroalgestammer, som kun manglede i Haptophyta, Dinophyta og Euglenoider (tabel 3). Den blev hyppigst påvist i to slægter af grønalger, prasinofytterne og streptofytterne. I prasinofytter var GLA imidlertid kun til stede i en ud af de fem slægter, der var tilgængelige for denne gruppe, Tetraselmis, og der i 12 ud af de 17 tilgængelige stammer og med varierende andele, dvs. 0,5-7,3% af det samlede FA-indhold. I Streptophyta var GLA mere udbredt, dvs. den blev påvist i 17 ud af 41 undersøgte slægter. GLA-fordelingen var ret variabel inden for stammer og arter af en bestemt streptofyt-slægt, hvilket svarer til resultaterne for ARA i andre slægter. Der blev fundet relativt høje procentdele af GLA i arter/stammer af Closterium (16,5 % i C. baillyanum SAG 50,89, 8 % i C. lunula SAG 7,84), men der blev ikke fundet GLA i de andre 12 stammer af denne slægt. På samme måde blev der i de mange stammer, der var til rådighed for Cosmarium (25) og Micrasterias (16), kun fundet GLA i henholdsvis 11 og 2 stammer. De højeste procentdele af GLA blev fundet i grønalgeklassen Chlorophyceae (29,9 % i Deasonia multinucleata SAG 25,95, 28,5 % i Desmodesmus multiformis SAG 26,91) og i Cyanobakterier (24,8 % i Spirulina maxima SAG 84,79). I omkring en tredjedel (32 %) af alle chlorofyte GLA-stammer havde denne FA en procentdel på 5 % og derover. Fordelingen af GLA i cyanobakterier var ret uensartet, dvs. at de 27 cyanobakteriestammer med GLA hovedsagelig var begrænset til tre slægter, Calothrix (8 stammer), Microcystis (7 stammer) og Spirulina (6 stammer). Også inden for hver af disse slægter var GLA-procenterne ret varierende, f.eks. varierede de i Spirulina fra 4,6 % til 24,8 %, og tre stammer var uden GLA. FA-sammensætningen er tidligere blevet anvendt til at skelne mellem cyanobakterier i isolater og naturlige prøver på artsniveau . Til at skelne arter af cyanobakterier blev kulbrintekompositionen anvendt som en yderligere markør i en tidligere undersøgelse, men i vores undersøgelse kunne vi ikke påvise nogen stoffer fra denne gruppe . Interessant nok var GLA det eneste FA, der blev påvist i mere end tre ud af de 223 undersøgte stammer. Derfor kan SAG-cyanobakteriestammerne groft sagt opdeles i dem med GLA til stede (få slægter) og dem, hvor der næsten ingen PUFA’er var til stede. Dette svarer til de tidligere resultater, der beskrev en bipartition af cyanobakterier, uafhængigt af deres taksonomiske position, i slægter, der producerer C-18 PUFA, og dem, der ikke gør det .

Den prasinofyte-slægt Tetraselmis præsenterede et interessant eksempel til at teste for FA-variation blandt nært beslægtede isolater. Ni stammer, der er henført til denne slægt, er blevet isoleret fra den samme (marine) lokalitet og betragtet som den samme art af isolatøren (U.G. Schlösser, pers. komm.). Kun i to stammer var DHA til stede, men i meget små spor (0,3 % og 0,4 %). Derimod blev ARA og GLA fundet i alle isolater med procenter, der varierede fra henholdsvis 0,8 % til 2,7 % og 0,5 % til 7,3 %.

2.2 Analyse af FA-fordelingsmønstre

Den påviste fedtsyresammensætning (FA) i de 2076 undersøgte stammer blev statistisk analyseret for at teste, om der er visse mønstre i FA-fordelingen blandt de forskellige undersøgte algegrupper, der kan svare til deres fylogenetiske relationer. I et første sæt af tre analyser (højere taksonomiske niveauer) blev det testet 1) om FA-fordelingsmønstre kan afspejle forskelle mellem algefylaer, der stammer fra primær (Plantae supergruppe) eller sekundær endocytobiose (Chromalveolater, Euglenoider) sammenlignet med cyanobakterier, der repræsenterer plastidoprindelse, 2) sondringen mellem fylaer inden for Plantae-supergruppen (Chlorophyta, Streptophyta, Rhodophyta/Glaucophyta) og 3) de vigtigste evolutionære slægtslinjer (klasser) inden for Chlorophyta. Et andet sæt analyser fokuserede på det generiske niveau, dvs. at det blev testet, om adskillelse af slægter som baseret på tidligere 18S rDNA-sekvensanalyser foreslået for Chlamydomonas s.l., Chlorella s.l. og Scenedesmus s.l. afspejles i FA-fordelingsmønstrene. I det første sæt analyser måtte de mange arter (266), der var repræsenteret som flere stammer (f.eks. Chlamydomonas moewusii, 28), reduceres til kun en enkelt stamme pr. art for at undgå bias. Dette omfattede også de mange stammer, som ikke var identificeret på artsniveau, dvs. som var mærket med “sp.” i stedet for et artsnavn (f.eks. Chlorogonium sp., 26). SAG’s Chlorophyta-stammer var særligt rige på sådanne multipelstammer. De stammer, hvor der kun blev påvist en enkelt FA, blev også udelukket. Dette reducerede det samlede antal stammer, der blev taget i betragtning i vores beregninger, til 1193. Stammerne blev derefter opdelt i elleve grupper, der groft sagt svarer til fylaer eller klasser (Additional file 2). Stammer, der tilhører Chlorophyta (61 % af alle undersøgte stammer), blev yderligere underopdelt i de tre klasser Chlorophyceae, Trebouxiophyceae og Ulvophyceae, mens de prasinofytiske SAG-grønalgestammer (1,7 % af alle undersøgte Chlorophyta-stammer) blev udelukket fra analyserne, fordi de kun omfattede meget få arter (10). Stammerne af Glaucophyta (15) og Rhodophyta (81) blev samlet behandlet som en sammensat enhed. Rhizaria – Chlorarachniophyta – var kun repræsenteret af en enkelt stamme og blev derfor udeladt fra de statistiske analyser.

Analyser på højere taksonomiske niveauer

Det blev testet, om fordelingsmønstre for FA-sammensætningen på de undersøgte stammer afgrænser de tre “supergrupper” af eukaryote alger, Plantae, Chromalveolater og Excavater (Euglenoider), og cyanobakterierne fra hinanden. Supergruppen Plantae omfatter udelukkende eukaryoter med plastider, der stammer fra primær endocytobiose, dvs. at en cyanobakterie blev omdannet til en organel gennem optagelse og tilbageholdelse i værtscellen efterfulgt af tab af en stor del af dens genom . Chromalveolate alger samt Euglenoiderne (den eneste algestamme af Excavates) erhvervede deres plastider gennem sekundær endocytobiose fra henholdsvis rhodofyte og en grønalge . For at få næsten lige mange stammer for alle fire grupper blev der tilfældigt udvalgt 100 stammer fra Plantae, Chromalveolates og Cyanobakterier, hvilket svarer nøje til det samlede antal euglenoide stammer (73), der blev taget i betragtning. Den ordination, der fremkom ved CVA (Canonical Variates Analysis, multigroup discriminant analysis), viste en stærk forskel mellem cyanobakterier/primære endocytobiose (Plantae) og de to grupper, der repræsenterer sekundær endocytobiose (Chromalveolates/Euglenoider) (figur 2). Den observerede forskel blev uden undtagelse understøttet af ikke-parametriske signifikanstests for flerdimensionale data (NP-MANOVA og ANOSIM). Ifølge SIMPER var den laveste observerede ulighed (63,55 %) mellem Cyanobakterier og Plantae, mens den højeste (77,29 %) var mellem Plantae og Chromalveolater. Den første kanoniske variabel (CV1) omfattede 99,99 % af alle mulige forskelle mellem de fire grupper, og derfor undersøgte vi for mulige korrelationer mellem denne akse og FA’er. Fire FA’er var signifikant og udelukkende korreleret med den første kanoniske variat (CV1), dvs. 16:0 (ρCV1 = -0,61/p < 0.001), 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,46/p < 0,001), 9-octadecanamid (ρCV1 = 0,41/p < 0,001) og 18:1(9Z) (ρCV1 = -0,17/p = 0,001). I en anden analyse blev det testet, om FA-fordelingsmønstre adskiller fylaer i supergruppen Plantae, dvs. de to slægter af grønalger, Chlorophyta og Streptophyta , og den sammensatte Rhodophyta/Glaucophyta-gruppe. Da sidstnævnte med 54 stammer var den mindste gruppe, blev den sammenlignet med lige store tilfældige prøver fra hver af Chlorophyta og Streptophyta (tabel 3). Ordineringsdiagrammet fra en CVA af de i alt 162 undersøgte stammer adskilte klart Rhodophyta/Glaucophyta-gruppen fra de to grønne algefyler (figur 3). CV1 omfattede 79 % af alle mulige forskelle, og selv CV2 var med 21 % ikke ubetydelig. Signifikanstestene, NP-MANOVA og ANOSIM, støttede sondringen mellem alle tre grupper. SIMPER viste, at den sammensatte gruppe Rhodophyta/Glaucophyta var ret forskellig fra de to grønne algefyler, dvs. at der var en ulighed på 70,55 % og 71,53 % i forhold til henholdsvis Chlorophyta og Streptophyta. Den laveste uoverensstemmelse (55,41 %) blandt de tre testede grupper var mellem Chlorophyta og Streptophyta. Der var fem FA’er, der var signifikant og udelukkende korreleret med CV1, nemlig 18:3(9Z, 12Z, 15Z) (ρCV1 = 0,77/p < 0,001), 20:4 (ρCV1 = -0.49/p < 0,001), 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) (ρCV1 = -0,59/p < 0,001), 18:1(9Z) (ρCV1 = 0,30/p = 0,001) og 16:0 (ρCV1 = -0,56/p = 0, 001). To FA’er var udelukkende korreleret med CV2, dvs. de diskriminerede Chlorophyta og Streptophyta, nemlig 18:1(9Z) (ρCV2 = -0,4477/p < 0,001) og 9-octadecanamid (ρCV2 = 0,34/p < 0,001). Langt den største andel af alle de betragtede stammer (60,3 %) var fra Chlorophyta, hvilket gjorde det interessant at teste, om FA-fordelingsmønstre kan skelne mellem de tre klasser af Chlorophyta, Chlorophyceae, Trebouxiophyceae og Ulvophyceae. Ulvophyceae var den mindste af de tre med kun 49 stammer, og derfor blev der anvendt tilfældige prøver af næsten samme størrelse (54) fra hver af de to andre klasser til de statistiske analyser. CVA’en afslørede ikke nogen særskilte grupper, dvs. at de analyserede stammer havde tendens til at danne tre grupper svarende til de tre grønalgeklasser, men med et betydeligt overlap mellem dem (figur 4). De tre klasser blev imidlertid fundet signifikant forskellige fra hinanden i både de anvendte signifikanstest og SIMPER. Sidstnævnte og korrelationsanalyser gjorde det muligt at betragte 9-octadecanamid (ρCV1 = -0,58/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) og FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) og FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0.001; ρCV2 = -0,53/p < 0,001) som de eneste variabler, der godt kunne skelne henholdsvis Ulvophyceae fra Chlorophyceae/Trebouxiophyceae og Trebouxiophyceae fra Ulvophyceae/Chlorophyceae.

Analyser på generisk niveau

De tre tidligere analyser viste, at fylogenetiske relationer på fyla- og klasseniveau blandt algegrupper blev afspejlet i FA-fordelingsmønstre ved hjælp af en stor stikprøve af stammer. Derfor testede vi i en anden gruppe af analyser, om forskelle i FA-fordelingsmønstre kan løse den samme skelnen mellem slægter som i rRNA-gensekvensanalyser. For at teste dette udvalgte vi tre slægter, som er meget udbredt i bioteknologiske anvendelser og godt repræsenteret af SAG-stammer, dvs. Chlorella s.l., Scenedesmus s.l. og Chlamydomonas s.l.. Nylige18S rRNA-gen-sekvensanalyser viste, at hver af de tre er para- eller polyfyletiske samlinger, der omfatter flere forskellige slægter. For Chlamydomonas udvalgte vi 17 arter (53 stammer), hvoraf 9 var repræsenteret af flere stammer (f.eks. C. reinhardtii, 16), som var fordelt på fem uafhængige slægter/klasser (= slægter) i 18S rDNA-fylogenien . For bedre at repræsentere “Oogamochlamys”-kladen blev der også medtaget to stammer fra UTEX-samlingen (2213, 1753). NMDS-ordinationen adskilte klart medlemmerne af “Reinhardtii”-kladen (øverst til højre i figur 5), bortset fra tre stammer, fra medlemmerne af “Chloromonas”-kladen (nederst til venstre i figur 5). “Chloromonas”-gruppen som afsløret af FA-mønstrene omfattede imidlertid også de tre undersøgte stammer fra “Moewusii”-kladen og fire fra “Oogamochlamys”-kladen, hvilket stod i modsætning til 18S rDNA-fylogenierne af . I modsætning til rDNA-fylogenierne opdelte FA-analyserne også Lobochlamys-slægten, dvs. at L. culleus var en del af “Chloromonas”-gruppen, mens L. segnis tilhørte “Reinhardtii-gruppen”. Stammer af Oogamochlamys blev også adskilt på begge FA-grupper, i modsætning til deres artstilknytninger som baseret på 18S rDNA-analyserne.

Species og stammer, der tidligere blev henført til en enkelt slægt Scenedesmus, viste sig ved rRNA-gen-sekvensanalyser faktisk at være fordelt på flere slægter. For eksempel er slægten Acutodesmus blevet udskilt fra Scenedesmus . Et NMDS-ordinationsplot af FA-fordelingsmønstre afslørede en tendens til, at de undersøgte stammer fordeler sig på to klynger, dvs. at en klynge bestående af 8 Acutodesmus-stammer (der hovedsagelig omfatter flere stammer af A. obliquus) var klart adskilt fra en anden klynge, der hovedsagelig indeholder stammer af Scenedesmus s.str. (figur 6). De mange stammer af S. vacuolatus blev grupperet sammen med fire andre stammer af slægten, bortset fra SAG 211-11n, som lå tæt på Acutodesmus-klyngen. De multiple stammer af A. obliquus var derimod fordelt på begge klynger (figur 6). Syv stammer af A. obliquus udgjorde hovedsagelig Acutodesmus-klyngen, mens fem andre A. obliquus-stammer grupperede sig sammen med stammer af Scenedesmus s.str. Dette betyder, at der inden for den samme grønalgeart, A. obliquus, findes to forskellige FA-mønstre. AFLP-fingeraftryk viste allerede omfattende genetisk variation blandt de mange stammer af A. obliquus, mens ITS2 rDNA-sekvenssammenligninger viste konspecificitet mellem de mange stammer, undtagen for SAG 276-20 (T. Friedl, upubl. observation). Derfor taler det forhold, at A. obliquus-stammer er adskilt i to FA-mønstergrupper, for det synspunkt, at genetiske forskelle, der opløses ved hjælp af AFLPs, kan svare til forskellige fænotypiske egenskaber. Det kan derfor være afgørende at registrere omhyggeligt, hvilken stamme der er blevet anvendt i enhver anvendelse . Selv om det blev konstateret, at stamme SAG 276-20 ikke tilhører den samme art, A. obliquus, tyder dens FA-mønster på, at den stadig kan tilhøre Acutodesmus, fordi den blev grupperet i Acutodesmus-klyngen (figur 6).

Chlorella vulgaris udgør et andet eksempel, hvor omfattende genetisk variation blandt flere stammer af den samme art er blevet påvist ved AFLP-analyser . De 15 multiple SAG-stammer af C. vulgaris blev sammenlignet med 19 andre Chlorella- og Chlorella-lignende stammer, dvs. deres nærmeste slægtninge, som det fremgår af 18S rDNA-fylogenierne, C. sorokiniana og C. lobophora, medlemmer af Parachlorella-kladen sensu samt mere fjernt beslægtede stammer, dvs. fra Watanabea- og Prasiola-kladerne sensu . NMDS-ordination baseret på FA-fordelingsmønsteret viste næsten ingen variation inden for de mange stammer af C. vulgaris og grupperede dem sammen, bortset fra stamme SAG 211-1e (figur 7). En anden klynge fjernt fra C. vulgaris blev dannet af medlemmer af Watanabea-kladen, mens Chlorella-lignende alger fra Prasiola-kladen ikke blev klynget sammen.