Forhøjede plasmaniveauer af 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin (8-OHdG) hos patienter med pseudoexfoliationsglaukom

Abstract

Søgsmål. For at undersøge systemisk oxidativ stress-induceret DNA-skade hos patienter med pseudoexfoliationsglaukom (PXG) estimerede vi plasmaniveauerne af 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin (8-OHdG) som en markør for oxidativ DNA-skade i sammenligning med kontroller. Desuden undersøgte vi også en kombineret effekt af lysyl oxidase-like 1 (LOXL1)-polymorfismestatus og 8-OHdG-niveauer på PXG-risiko. Materialer og metoder. Der blev udført en retrospektiv case-kontrolundersøgelse for at estimere plasmaniveauerne af 8-OHdG hos 41 PXG-patienter og 45 ikke-glaukomatøse kontroller ved hjælp af enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Assayet blev udført i to eksemplarer på en automatiseret ELISA-analysator. To almindelige polymorfismer (rs1048661 og rs3835942) i LOXL1-genet blev genotypet ved Sanger-sekventering. Resultater. Gennemsnits- og medianniveauerne af 8-OHdG var signifikant forhøjet i PXG-tilfælde () og hos mandlige forsøgspersoner (). Forsøgspersoner med niveauer over tredje kvartil (75 % percentil) udviste en signifikant øget risiko for PXG (odds ratio = 4,06, 95 % konfidensinterval (CI = 1,11-14,80, )). Sammenligninger inden for og mellem grupper viste, at de gennemsnitlige niveauer var højere hos personer med LOXL1-risikovariant (G/G), men ikke statistisk signifikant. I logistisk regressionsanalyse viste både 8-OHdG () og rs3835942 () en statistisk signifikant effekt på PXG-resultatet. Effekten forsvandt dog, når alder, køn og rs1048661 blev inkluderet. Der blev observeret en signifikant positiv korrelation mellem 8-OHdG-niveauer og intraokulært tryk (, ) og cup/disc-ratio (, ). Desuden var arealet under kurven i receiver operating characteristic-analysen statistisk signifikant () med en værdi på 0,635 (95 % CI = 0,518-0,751). Konklusion. Undersøgelsen viser en sammenhæng med forhøjede plasmaniveauer af 8-OHdG hos patienter med PXG, hvilket understøtter den rolle, som oxidativt stress og øget oxidativ DNA-skade spiller i udviklingen af PXG.

1. Introduktion

Glaukom er en af de førende årsager til irreversibel blindhed på verdensplan , herunder i Saudi-Arabien . Som følge af blokeret udstrømning af kammervæske ved trabekelværket (TM) betragtes forhøjet intraokulært tryk (IOP) som en primær risikofaktor, der udløser død af retinale ganglieceller (RGC’er) og progressivt tab af RGC-axoner, hvilket forårsager glaukomatøs optisk neuropati . Pseudoexfoliationsglaukom (PXG) er ofte karakteriseret ved ophobning af unormale fibrillære ekstraceullære materialer i det forreste segment af øjet, primært langs pupilgrænsen, hvilket betragtes som et patologisk kendetegn for sygdommen . Sammenlignet med det mere almindelige primære åbenvinklet glaukom (POAG) viser patienter med PXG ofte et mere aggressivt klinisk forløb med højere IOP, større cupping, alvorlige synsfeltdefekter og en dårligere prognose med hurtig progression af sygdommen . Der mangler systematiske epidemiologiske undersøgelser i litteraturen for at få kendskab til den nøjagtige prævalens af PXG i Saudi-Arabien. Det er imidlertid blevet observeret, at ud af ca. 600 nye glaukomtilfælde, der er registreret på vores glaukomafdeling på King Abdulaziz University Hospital i Riyadh, er mindre end 10 % af disse tilfælde diagnosticeret med PXG.

PXG repræsenterer en kompleks og multifaktoriel sygdom, der opstår hos voksne. Sygdommen involverer både genetiske og miljømæssige faktorer, der bidrager til den ætiologiske patofysiologi af sygdommen . Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) er et stærkt kandidatgen, der rapporteres at bidrage til risikoen for udvikling af PXG i flere etniske grupper, herunder saudiarabere. LOXL1 er involveret i dannelse og stabilitet af ekstracellulær matrix . Der er stærke beviser for, at oxidativ stressmekanisme(r) spiller en rolle i patogenesen for PXG . Oxidativ stress induceres generelt gennem dannelse af reaktive oxygenarter (ROS) såsom superoxid, peroxid og hydroxylradikaler, der kan igangsætte og sprede frie radikaler . Akkumulationen af ROS-niveauer i cellerne inducerer oxidativ skade i makromolekyler som lipider, proteiner, RNA, DNA og mitokondrier, hvilket resulterer i deres cellulære dysfunktion og/eller apoptose . Det er blevet påvist, at oxidativ stress forårsager en stigning i IOP ved at igangsætte TM-degeneration og derved hæmme den vandige udstrømningsvej . Mutationer, haplogrupper og nedsat respiratorisk aktivitet i mitokondrierne er også blevet forbundet med forskellige typer glaukom . Desuden er en polymorfi i glutathion S-transferase (GST)-genet, et enzym, der er involveret i afgiftning af peroxiderede lipider og forskellige skadelige toksiner, også blevet forbundet med glaukom . Nedsat GST-aktivitet kan forstyrre afgiftning af oxidative metabolitter og forværre de skadelige virkninger af oxidativt stress på synsnerven . Den samlede antioxidantstatus (TAS) i biologiske prøver er en vigtig indikator for oxidativt stress og et nyttigt redskab til at forudsige den oxidative status . Vores tidligere undersøgelse har vist, at plasma TAS-niveauerne var signifikant lave hos PXG-patienter sammenlignet med kontroller, hvilket understøtter den rolle, som oxidativt stress spiller i patogenesen af PXG . Desuden rapporterede vi også en kombineret effekt af LOXL1-allelerne og den nedsatte TAS, der kan bidrage til den samlede risiko for PXG . Hos mennesker har in vivo eksperimenter vist, at oxidative DNA-skader er betydeligt mere rigelige i TM-cellerne hos glaukom-patienter . Desuden var både øget IOP og synsfeltskader signifikant relateret til mængden af oxidative DNA-skader, der påvirker TM-cellerne . Oxidativ stress/ROS kan fremkalde brud eller basemodifikationer i DNA’et, hvilket resulterer i frigivelse af DNA-oxidationsprodukter, herunder 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin (8-OHdG) . 8-OHdG er et af de mange produkter af DNA-oxidation, der let kan kvantificeres, og det bruges almindeligvis som en biomarkør til at vurdere oxidativ DNA-skade .

Sigtet med denne undersøgelse var at undersøge systemisk oxidativ stress-induceret DNA-skade hos patienter med PXG. Vi estimerede plasmaniveauer af 8-OHdG som en markør for oxidativ DNA-skade og sammenlignede det med ikke-glaukomatøse raske kontroller. Derudover undersøgte vi også den kombinerede effekt af LOXL1-polymorfismestatus og 8-OHdG-niveauet på risikoen for PXG.

2. Materialer og metoder

2.1. Undersøgelsespopulation

Undersøgelsen overholdt principperne i Helsinki-erklæringen og blev godkendt af det institutionelle review board og den forskningsetiske komité (godkendelsesnummer # 08-657). Efter skriftligt informeret samtykke blev deltagere af saudiarabisk oprindelse med etableret klinisk diagnose af PXG () og etnisk matchede sunde kontroller () rekrutteret til undersøgelsen på King Abdulaziz University Hospital i Riyadh, Saudi-Arabien. Inklusions- og eksklusionskriterierne for patienter og kontroller er blevet beskrevet tidligere .

2.2. Plasma- og DNA-præparering

Plasmaprøver blev udtaget fra EDTA-blod efter centrifugering ved 5500 ×g i 5 minutter. DNA blev ekstraheret fra det buffy lag ved hjælp af illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Opbevaringen foregik ved -80 °C indtil brug.

2.3. Estimering af plasmaniveauer af 8-hydroxy 2′-Deoxyguanosin

Evalueringen af 8-OHdG-niveauerne blev udført ved hjælp af et kommercielt kit (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) baseret på en kompetitiv sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Assayet blev udført i to eksemplarer på en ChemWell-T automatiseret ELISA-analysator (Awareness Technology Inc., FL, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. 8-OHdG-niveauerne blev fastsat ved hjælp af standardkurven og udtrykt i ng/mL.

2,4. LOXL1 Sanger-sekventering

DNA-prøver blev sekventeret for de to almindelige polymorfismer i LOXL1-genet (rs1048661 og rs3825942) ved hjælp af primere og amplifikationsbetingelser som beskrevet andetsteds.

2.5. Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± SD og median for kontinuerlige variabler og som antal og procentdel for kategoriske variabler. Normalitetstest for 8-OHdG-niveauer blev udført ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov-testen. Gennemsnitsforskelle mellem grupper blev testet ved hjælp af Student’s t-test. Mann-Whitney U-testen blev anvendt til at sammenligne medianværdierne mellem patienterne og kontrollerne. De kategoriske variabler blev testet ved hjælp af chi-square-test og Fisher’s exact-test, hvor det var relevant. Korrelationstesten blev foretaget ved hjælp af Pearsons metode. Der blev foretaget en binær logistisk regressionsanalyse for at vurdere indvirkningen og effekten af de gennemsnitlige 8-OHdG-niveauer og andre risikofaktorer på sygdomsudfaldet. Der blev genereret en ROC-kurve (receiver operating characteristic), og AUC-værdien (area under the curve) blev analyseret ved hjælp af Mann-Whitney-testen. Odds ratio (OR) blev beregnet, og et konfidensinterval (CI) blev sat til 95 %. Alle statistiske tests var tosidede, og en værdi under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev udført med SPSS version 19.0 (IBM Corp., Armonk, New York, USA) og StatView software version 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).

3. Resultater

3.1. Undersøgelsespopulation og 8-OHdG-niveauer

Som det fremgår af tabel 1, var der ingen signifikant forskel mellem PXG-tilfælde og kontroller med hensyn til alder, køn, systemisk sygdomsstatus, rygning og familieanamnese for glaukom. Normalitetstest for 8-OHdG-niveauer viste en skæv fordeling (). Både middel- og median 8-OHdG-niveauerne var signifikant forhøjede hos PXG-tilfældene og de mandlige forsøgspersoner sammenlignet med kontrolpersonerne (tabel 1). Figur 1(a) og 1(b) viser box-plot-repræsentationen af 8-OHdG-niveauer i henhold til henholdsvis sygdomsstatus og kønsfordeling.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Niveauer af 8-OHdG og risiko for PXG

For at vurdere risikoen for PXG i forbindelse med stigende niveauer af 8-OHdG blev 8-OHdG-koncentrationerne dikotomiseret (ikke kategoriseret som tilfælde og kontroller) ved 50. percentil (eller medianværdi) og efter kvartiler (tabel 2). Den samlede mediangrænseværdi for 8-OHdG-niveauet var 17,68 ng/mL. Selv om tilfældene viste en øget risiko for sygdom ved dette niveau (OR = 1,76, 95 % CI = 0,75-4,15), var forskellen ikke signifikant (). På samme måde blev der ved hjælp af kvartilfordeling identificeret to cutoff-niveauer, nemlig 10,08 ng/mL (første kvartil eller 25. percentil) og 27,72 ng/mL (tredje kvartil eller 75. percentil). Ved hjælp af disse to grænseværdier blev emnerne derefter kategoriseret i tre grupper: mindre end første kvartil, interkvartil og større end tredje kvartil (tabel 2). Samlet set var der ingen signifikant additiv effekt af stigende niveauer af 8-OHdG- og PXG-resultatet (χ2 = 4,87, df = 2; ). Desuden viste forsøgspersoner med interkvartilniveauer sammenlignet med 8-OHdG-niveauer mindre end det første kvartil (<10,08 ng/mL) en ikke-signifikant øget risiko for sygdom (OR = 2,50, 95 % CI = 0,81-7.63, ), mens forsøgspersoner med niveauer større end tredje kvartil (75. percentil) udviste en signifikant øget risiko for PXG (OR = 4,06, 95 % CI = 1.11-14,80, ).

3.3. 8-OHdG-niveauer og LOXL1-polymorfismer

Vi undersøgte yderligere genotypeeffekten af polymorfismerne rs1048661 (g.5758 G>T) og rs3825942 (g.5758 G>A) i LOXL1-genet på 8-OHdG-niveauer i PXG-tilfælde og kontroller. Samlet set var der, som det fremgår af tabel 3, ingen signifikant forskel mellem 8-OHdG-niveauer og forskellige genotyper for begge LOXL1-polymorfismer (figur 1(c) og 1(d)).

For rs1048661 var G/G den mest almindelige genotype, efterfulgt af G/T og T/T. Der blev ikke observeret nogen T/T homozygositet i patientgruppen sammenlignet med kun én i kontrolgrupperne. De gennemsnitlige 8-OHdG-niveauer blev observeret at være højest i G/G-genotyperne sammenlignet med G/T-, T/T- eller G/T + T/T-grupperne. Disse niveauer varierede dog ikke signifikant både inden for og mellem sammenligningerne af undersøgelsesgrupperne.

Sådan var G/G for rs383592 den mest udbredte genotype, efterfulgt af G/A- og A/A-genotyperne, hvor sidstnævnte var fraværende hos PXG-patienterne. G/G var den mest almindelige genotype, der udviste de højeste niveauer af 8-OHdG i sammenligning med G/A, A/A eller G/A + A/A-grupperne. Niveauerne varierede ikke signifikant mellem tilfælde og kontroller for G/G-genotyperne (). Desuden viste en sammenligning inden for grupperne i kontrollerne heller ikke nogen signifikant genotypeeffekt på 8-OHdG for G/A (), A/A, () og G/A + A/A () sammenlignet med G/G-genotypen.

3.4. 8-OHdG-niveauer og andre risikofaktorer

Med henblik på at undersøge virkningen af alder, køn, LOXL1-polymorfismer og 8-OHdG-niveauer hos patienter med PXG blev der udført en binær logistisk regressionsanalyse med syg/ikke-sygdom som en afhængig variabel (resultat). Analysen viste, at både 8-OHdG () og rs3835942 () har en statistisk signifikant effekt på sygdomsudfaldet. I en kombineret analyse med alder, køn, 8-OHdG, rs1048661 og rs3835942 viste ingen af disse risikofaktorer imidlertid nogen signifikant indvirkning på PXG (tabel 4).

3.5. Korrelation mellem 8-OHdG og andre glaukomindikatorer hos PXG-patienter

Der blev observeret en signifikant positiv korrelation mellem 8-OHdG og IOP (, ) og cup/disc ratio (, ), i modsætning til ingen med alder (, ) og antal antiglaukommedicinering (, ).

3.6. ROC-kurve og 8-OHdG

ROC-kurveanalyse af 8-OHdG-niveauer hos PXG-patienter og kontroller afslørede en AUC på 0,635 (95 % CI = 0,518-0,751), der var statistisk signifikant (), hvilket indikerer, at plasmaniveauerne af 8-OHdG kunne skelne tilfredsstillende mellem PXG-patienter og kontroller.

4. Diskussion

Øget ROS, oxidativ skade og ubalance mellem prooxidantstatus og antioxidantstatus er kritiske faktorer, som bidrager væsentligt til glaukomatøs neurodegeneration . Denne undersøgelse rapporterer om øgede niveauer af systemisk 8-OHdG, en markør for oxidativ stress-induceret DNA-skade, hos patienter med PXG.

DNA-skade kan påføres af både extrinsiske og intrinsiske agenser såsom ioniserende stråling, ultraviolet lys, giftige kemikalier/metalioner og ROS, der genereres som følge af normal cellulær metabolisme af ilt . De endogene processer, der plausibelt kan bidrage til en igangværende DNA-skade in vivo, omfatter oxidativ methylering, depurinering og deaminering . De ROS-inducerede skader omfatter base- og sukkerlæsioner, protein- og DNA-krydsforbindelser og enkeltstrengs-/dobbeltstrengsbrud. Desuden er basen guanin mest modtagelig for oxidative modifikationer på grund af dens mindste redoxpotentiale . Det mest almindelige biprodukt, der dannes som følge af oxidativ modifikation af guanin ved hjælp af hydroxylradikaler, er 8-hydroxyguanin (8-OH-Gua) og dets 2′-deoxynukleosidækvivalent, 8-OHdG, som foreslås at være en fremragende markør for oxidativ skade på DNA . En række undersøgelser har givet stærke beviser for en sammenhæng mellem forhøjede niveauer af 8-OHdG og glaukomatøs optisk neuropati .

Initiale undersøgelser af menneskelige TM-prøver, der er udtaget under filtreringskirurgi, har påvist tilstedeværelsen af høje niveauer af 8-OHdG hos patienter med glaukom . I en undersøgelse af Sorkhabi et al., der omfattede 15 POAG- og 13 PXG-patienter, var både vandig humor (AH) og serum 8-OHdG-niveauer høje hos patienterne sammenlignet med kontroller . Tilsvarende er der rapporteret om høje serumniveauer af 8-OHdG hos patienter med primær vinkellukkende glaukom sammenlignet med normale personer . Yuki og Tsubota rapporterede, at et forhøjet 8-OHdG/kreatinin-niveau i urinen var forbundet med glaukomatologisk synsfeltudvikling hos personer med normalspændingsglaukom . I en anden nyere undersøgelse af Mohanty et al. var både plasma- og AH 8-OHdG-niveauet signifikant højere hos POAG-patienter i sammenligning med kataraktkontroller . Denne effekt blev tilskrevet reduceret ekspression af DNA-reparationsenzymer i base excision repair pathway . Desuden rapporterede undersøgelsen også en stærk positiv korrelation mellem systemiske (plasma) 8-OHdG-niveauer og AH 8-OHdG-niveauer, hvilket tyder på, at systemiske 8-OHdG-niveauer kunne være forudsigende for lokale 8-OHdG-niveauer i øjet .

Den nøjagtige rolle af 8-OHdG og/eller oxidativ stress, der fører til udvikling og progression af glaukomatøs optisk neuropati, er stadig spekulativ. 8-OHdG er blandt de bedst karakteriserede oxidative læsioner, og det kan give anledning til C : G- til A : T-transversionsmutationer . Nogle læsioner i DNA er genstand for cellulær reparation ved hjælp af in vivo DNA-reparationsmekanismer, der spalter det beskadigede DNA . Manglende reparation af disse skader kan imidlertid have alvorlige biologiske konsekvenser og kan føre til carcinogenese eller udvikling af neurodegenerative lidelser . 8-OHdG kan også i betydelig grad fremkalde telomerforkortelse, som kan bidrage til fysiologiske og patologiske tilstande in vivo . Endvidere er det blevet foreslået, at 8-OHdG kan spille en epigenetisk-lignende regulerende rolle i celler, der udsættes for oxidativt stress i forbindelse med regulering af gentranskription . Desuden er de unormale virkninger af oxidativ stress og ROS i glaukomets patogenese via øget IOP og/eller hypoxi, TM-degeneration, gliacelleskader, autofagi, mtDNA-skader, nuclear-kappa B-aktivering, peroxynitritstress og okulær hæmodynamik, der stimulerer apoptose og inflammatoriske veje for at fremme RGC-død og skader på synsnerven, blevet veldokumenteret . Øgede niveauer af 8-OHdG observeret i vores undersøgelse kan plausibelt bidrage til PXG-patogenese ved lignende mekanisme(r).

En stærk association af to missense-varianter, rs1048661 og rs3825942, i LOXL1-genet med PXG er konsekvent blevet replikeret i flere etniske grupper, herunder saudiarabere . En fuldstændig forståelse af denne genetiske forbindelse til PXG-patologi er stadig ikke kendt; der er dog blevet postuleret en række mekanismer. Disse omfatter dens virkning på elastindannelsen, ændret LOXL1-ekspression, splejsningseffekt eller muligheden for deres tilknytning/forbindelse med en faktisk uidentificeret funktionel allel . Vi undersøgte genotypeeffekterne af disse to almindelige varianter på 8-OHdG og deres kombinerede virkning på risikoen for PXG. Det blev ikke konstateret, at genotyperne havde indflydelse på 8-OHdG-niveauerne, selv om niveauerne var høje i risikovarianterne (G/G). Både 8-OHdG og rs3835942 blev fundet at være signifikante risikofaktorer for PXG. Denne signifikans gik dog tabt i en kombineret analyse, der også omfattede alder, køn og rs1048861-genotyper. En mangel på tilstrækkeligt antal i hver genotypegruppe kunne være en sandsynlig forklaring på dette tab og fraværet af en signifikant effekt.

Et øget IOP og synsfeltskader er blevet signifikant korreleret med mængden af oxidative DNA-skader i TM-cellerne . Tilsvarende viste IOP og cup/disc-forholdet også en signifikant positiv korrelation med 8-OHdG-niveauerne i vores undersøgelse, hvilket tyder på dets mulige anvendelighed som en markør for sygdommens sværhedsgrad. Desuden har en række rapporter støttet eksistensen af en omvendt relation mellem antioxidantforsvarsmekanisme(r) og oxidativt stress i patofysiologien ved glaukom . Vores gruppe har også tidligere rapporteret om signifikant reduceret plasma total antioxidantstatus (TAS) hos PXG-patienter sammenlignet med kontroller . Interessant nok var TAS-niveauer tilgængelige for PXG-patienterne (ikke for kontrollerne; data ikke vist) inkluderet i denne undersøgelse, der viste en signifikant negativ korrelation mellem 8-OHdG og TAS hos PXG-patienter (, ), hvilket understøtter den plausible rolle af øget oxidativ stress og nedsatte antioxidante forsvarsmekanismer i PXG.

Fundene i denne undersøgelse kræver en forsigtig fortolkning på grund af dens visse begrænsninger. For det første må vi erkende, at den systemiske stigning i 8-OHdG måske ikke nøjagtigt afspejler situationen i øjets forreste kammer, hvor celler/væv konstant udsættes for en større mængde af frie radikaler og dermed er mere direkte involveret i udvikling og progression af glaukom gennem oxidative stressmekanismer. Dette vil kræve en yderligere validering i AH-prøver. For det andet er undersøgelsen af rent beskrivende karakter og giver ikke nogen tidsmæssig eller mekanistisk dokumentation eller antyder nogen kausale implikationer af forhøjet 8-OHdG i PXG. Endelig er der i denne undersøgelse blevet undersøgt et relativt lille antal prøver. En gentagelse i en meget større kohorte ville helt sikkert styrke observationerne i denne undersøgelse. Ikke desto mindre udviser undersøgelsen i betragtning af en gennemsnitlig forskel (effektstørrelse) på 13 ng/mL i 8-OHdG-koncentrationen som observeret mellem PXG-tilfælde og kontroller, med en gennemsnitlig standardafvigelse på 20 og en type I-fejl på 0,05 (tosidet), en effekt på >80%.

5. Konklusion

For at konkludere, viser undersøgelsen et øget niveau af systemisk 8-OHdG hos patienter med PXG, hvilket understøtter en association af denne markør med PXG og den plausible rolle af oxidativ stress og øget oxidativ DNA-skade i PXG-ætiologi.

Datatilgængelighed

Dataene, der understøtter konklusionerne i denne artikel, er alle præsenteret i artiklen.

Etisk godkendelse

Undersøgelsen overholdt principperne i Helsinki-erklæringen og havde modtaget godkendelse fra Institutional Review Board and Research Ethics Committee of College of Medicine, King Saud University, Riyadh, Saudi-Arabien.

Samtykke

Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere, inden de blev inkluderet i denne undersøgelse.

Interessekonflikter

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter. Finansieren havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen, i indsamling, analyse og fortolkning af data og i skrivning af manuskriptet. Forfatterne er alene ansvarlige for indholdet og skrivningen af artiklen.

Anerkendelser

Forfatterne vil gerne takke Vice Deanship of Scientific Research Chair og Gluacoma Research Chair in Ophthalmology ved King Saud University, gennem hvem dette arbejde blev støttet.