Frontiers in Pharmacology

Indledning

Brug af naturmedicin er en gammel tradition, der stadig praktiseres, og >60% af verdens befolkning behandler forskellige sundhedsproblemer, herunder kræft, ved hjælp af traditionel medicin som førstevalg (Sultana et al., 2014). Kræftbehandling er imidlertid kompleks, og de nuværende muligheder for patienterne afhænger af kræfttype og -stadie ud over patientens alder, køn og generelle helbredstilstand. Selv om kemoterapi normalt er vellykket i de tidlige stadier af kræft, afhænger dens effektivitet af lægemiddeladministrationsskemaet og patientens fysiologiske tilstand. Ikke desto mindre er den største bekymring i forbindelse med kemoterapi dens toksicitet, da de anvendte lægemidler har en tendens til at påvirke både kræftceller og normale celler med et højt proliferativt indeks, der genererer kollaterale skader hos patienterne. Desuden kan kræftcellerne udvikle behandlingsresistens og udviser metastase, hvilket mindsker responsen på behandlingen og reducerer muligheden for sygdomsfri overlevelse. Derfor er en af de vigtigste udfordringer i forbindelse med lægemiddelforskning at nedbringe toksiciteten af kemoterapeutiske midler og udvikle mere effektive og effektive lægemidler for at forbedre behandlinger, helbredelsestider og patienternes samlede livskvalitet.

Naturlige produkter har udgjort en rig kilde til kemiske strukturer til udvikling af behandlinger mod kræft. Inden for onkologisk farmaci er 49 % af de lægemidler, der anvendes i kemoterapi, afledt af eller inspireret af naturlige kilder såsom planter, mikroorganismer og marine organismer (Newman og Cragg, 2016). Eksempler omfatter vincaalkaloider og taxaner (tubulinbindende midler) foruden podofyllotoxiner, anthracykliner og etoposider (topoisomerasehæmmere) (Da Rocha et al., 2001; Nobili et al., 2009). Disse eksempler illustrerer naturprodukternes potentiale i forbindelse med lægemiddelopdagelse.

AAA’erne er sekundære metabolitter, der produceres af Annonaceae-familien (figur 1). I traditionel medicin anvendes frugten af Annona-slægten til behandling af feber, smerter, gigt, reumatisme, diarré og gigt, og dens blade til behandling af diabetes, hovedpine og søvnløshed (Moghadamtousi et al., 2015a). Annona reticulate er blevet anvendt i Afrika som en anti-dysenterisk og anti-helminthisk behandling, og A. squamosa anvendes i Indien til behandling af forskellige tilstande, herunder maligne tumorer (Savithramma et al., 2011). Endvidere er A. muricata et populært lægemiddel i Amerika, Afrika og Indien til behandling af kræft (Moghadamtousi et al., 2015a), mens A. macroprophyllata, A. muricata og A. purpurea i Mexico anvendes til behandling af hudtumorer og mavekræft (Alonso-Castro et al., 2011; Brindis et al., 2013). Ifølge en etnofarmakologisk gennemgang af medicinske planter i Mexico kunne slægten Annona også udforskes til behandling af tyktarmskræft (Jacobo-Herrera et al., 2016). Disse beviser tyder på, at AA’erne er molekyler med et betydeligt bioaktivt potentiale.

Over 500 AA’er er blevet beskrevet til dato; disse forbindelser er karakteriseret ved en lang alifatisk kæde med en α, β-umættet γ-lactonring og 0-3 tetrahydrofuran (THF)-ringe (Yuan et al, 2015), og har vist cytotoksisk aktivitet mod forskellige humane kræftcellelinjer (dvs. lunge, bryst, tyktarm, nyre, pancreas, prostata, lever og blære) (gennemgået i Zeng et al, 1996; Chávez og Mata, 1998; Wang et al., 2002; Yuan et al., 2003; Mangal et al., 2016; Miao et al., 2016a; Miao et al., 2016b) ud over in vivo antitumoraktivitet (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b). Heri gennemgik vi de seneste rapporter om AA’er i forbindelse med lægemiddelopdagelse-onkologi.

Materialer og metoder

Vi foretog en søgning i PubMed-databasen ved hjælp af følgende nøgleordstermer: “acetogeniner og kræft”, “acetogeniner antitumoraktivitet”, “acetogeniner cytotoksicitet” og “acetogeniner virkningsmekanisme”, blandt andre kombinationer. Vi gennemgik artikler, der er offentliggjort i løbet af de sidste 15 år, og som var baseret på to kriterier: planter med medicinsk anvendelse og den bioassay-vejledte fraktioneringsmetodologi. De in vitro-data, der er rapporteret heri, er udelukkende baseret på aktiviteten af rene forbindelser, mens der for in vivo-undersøgelser også blev taget hensyn til urteekstrakter på grund af manglen på analyser i dyremodeller.

Resultater og diskussion

In vitro-undersøgelser

I forbindelse med naturprodukter er der en tendens til, at søgningen efter bioaktive molekyler indebærer en bioassay-styret fraktionering af ekstrakter for at finde det eller de mastermolekyler, der er ansvarlige for aktiviteten. Mange sekundære metabolitter kan imidlertid være rettet mod flere kendetegn ved kræft. Generelt er medicinalindustrien interesseret i lægemidler, der udviser mere end én molekylær interaktion og omfatter forskellige molekylære mål.

Acetogeniner er molekyler med et stort potentiale for fremtidig kræftbehandling. Deres mest fremtrædende biologiske aktivitet er hæmning af det mitokondrielle kompleks I på grund af deres bis-THF-struktur. Det er nemlig tidligere blevet rapporteret, at mono-THF AA’er, der bærer en alkylkæde, der forbinder lactondelen med THF-gruppen, er ikke-kompetitive inhibitorer af kompleks I (dvs. NADH: ubiquinon oxidoreduktase) i respirationskæden, hvilket fører til en blokering af fosforylativ oxidation og et efterfølgende fald i ATP-produktionen (Tormo et al., 1999; Chen et al., 2012). En sådan hæmning involverer en stor gruppe af veje, der kan inducere celledød, herunder apoptose og autofagi, eller virke i andre metaboliske netværk som inhibitorer af enzymet laktatdehydrogenase A, som antioxidant eller ved at standse cellecyklusen.

Dertil kommer, at A. muricata (Moghadamtamtousi et al, 2015a) og A. squamosa L. (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b; Chen et al., 2012c; Chen et al., 2016) er blevet rapporteret at have cytotoksisk aktivitet mod flere humane eller andre pattedyrs kræftcellelinjer. Især AA’erne annosquatinerne A (1) og B (2) udviser selektivitet over for henholdsvis MCF-7- og A-549-cellelinjerne (Chen et al., 2012c). Tabel 1 viser de senest opdagede AA’er, der udviser cytotoksisk aktivitet, foruden andre mindre nyere forbindelser, der udviser antineoplastisk aktivitet in vivo (tabel 2).

Apoptose er en naturlig strategi for celledød, der dræber unødvendige eller beskadigede celler. De vigtigste gener, der er involveret i denne proces, er p53 og bcl2-familien; førstnævnte er en tumorsuppressor, mens sidstnævnte enten kan være proapoptotiske (bl.a. BAD, BAX og BAK) eller antiapoptotiske (bcl2 og bcl-x) (Okada og Mak, 2004). Den primære funktion af p53 er at forhindre replikation af celler med DNA-skader. Derfor er p53 inaktiv, og de beskadigede celler fortsætter med at vokse og replikere DNA-mutationer, hvilket resulterer i sygdomme som f.eks. kræft (Igney og Krammer, 2002; Okada og Mak, 2004). Den hidtidige forskning kan således inddeles i to hovedemner: apoptoseinduktion eller apoptosemodstandsmekanismer.

De nuværende apoptoseinducerende kemoterapier forårsager alvorlige sekundære virkninger for patienterne. Som sådan er søgningen efter mindre giftige lægemidler en prioritet, og naturprodukter forventes at kunne bidrage til udviklingen af lægemidler, der modulerer apoptose. I denne sammenhæng opregulerer AA’er aktiviteten af caspase 3 og 8 (apoptoseeffektorer), samtidig med at de nedregulerer ekspressionen af survivin og Bcl-2 og derved øger apoptosen. AA annonacin (3) fremmer apoptose i kræftceller ved at aktivere caspase 3- og Bax-vejene (Yuan et al., 2003), mens squamocin inducerer apoptose gennem ekspression af de proapoptotiske gener Bax og Bad, hvilket resulterer i spaltning af PARP og øget aktivitet af caspase 3 i T24-kræftceller i blæren (Yuan et al., 2006). Dette står i kontrast til tidligere resultater, hvor squamocin ikke inducerede apoptose i brystkræftceller, men hindrede proliferation ved at blokere cellecyklusen i G1-fasen (Raynaud et al., 1999).

Methanolekstraktet af A. reticulata hæmmer ekspressionen af caspase 6 og 9 i kolon- og leverkræftceller (Mondal et al, 2007), mens de organiske og vandige ekstrakter af A. squamosa nedregulerer ekspressionen af Bcl-2 i MCF-7 brystkræftceller og K-562 leukæmiceller, hvilket indikerer deres virkning som apoptoseinducerende stoffer (Pardhasaradhi et al., 2005). Desuden inducerer bladekstrakt af A. muricata ekspressionen af caspase 3 og 9 og hæmmer celleproliferation ved at reducere phospho-ERK og phospho-AKT i MIA PaCa-2-celler (Yiallouris et al., 2018).

A AA’erne fører også til cyklusarrest, hvilket har betydning for tumorcellers proliferation. AA’er regulerer cellecyklusen i G1/S-overgangen ved at hæmme cyclin D1-ekspression i humane hepatocellulære karcinomceller (Qian et al., 2015). I denne sammenhæng stopper A. muricata-ekstraktet cellecyklusen i G1-fasen og reducerer antallet af celler i S-fasen på en koncentrationsafhængig måde ved at reducere ekspressionen af cyklin D1, et vigtigt regulerende protein i cellecyklusen (Torres et al., 2012). Et lignende resultat blev observeret for squamocin, som stopper cellerne i G1-fasen i T24 blærekræftceller (Yuan et al., 2006). På trods af cellecyklussens relevans har kun få undersøgelser behandlet, hvordan AA’er påvirker denne mekanisme.

Aerob glykolyse, en mekanisme, der anvendes af tumorceller til at skaffe energi i fravær af ilt (Figueroa-González et al., 2016; García-Castillo et al., 2017), er også et mål for AA’er. Forskellige proteiner og glykolytiske enzymer opreguleres af HIF-1, en vigtig transkriptionsfaktor, der er involveret i tumor aerob glykolyse, i kræftceller. Interessant nok sænkede A. muricata-ekstraktet ekspressionen af HIF-1α og NF-κB og niveauerne af glukosetransportøren GLUT1 og HKII- og LDHA-enzymerne i pancreaskræftceller (Torres et al., 2012). Desuden viste bladekstrakt af A. muricata antiproliferative virkninger i kræftcellelinjer og fremmede celledøden ved hæmning af NKA- og SERCA-pumperne (Yiallouris et al, 2018).

På den anden side koder MDR1-genet for cellemembran-glykoprotein P, et vigtigt transportprotein, der udstøder kræftmedicin fra cellernes indre, hvorved deres intracellulære ophobning begrænses og deres toksicitet mindskes (Figueroa-González et al., 2012). Sekundære metabolitter, såsom flavonoler, ginsenosider, polyfenoler, alkaloider og harpiksglykosider, har vist interessante resultater med hensyn til modulering af P-gp i kræftcellelinjer (Phang et al., 1993; Beck et al., 1988; Silva et al., 2001; Jodoin et al., 2002; Zhou et al., 2004; Figueroa-González et al., 2012). Desuden kan AA’er nedregulere ekspressionen af MDR1- og MRP1-generne i lægemiddelresistent humant hepatocellulært karcinom samt ekspressionen af topoisomerase IIα og glutathion S-transferaseΠ (Qian et al., 2015).

Nyligt har autofagi vakt interesse som en mekanisme for celledød. Autofagi er en katabolisk proces, som eukaryote celler aktiverer, når de er under stress, som f.eks. cellesult eller tilstedeværelse af patogener (He og Klionsky, 2009). Under denne proces genbruger cellen proteiner eller ikke-funktionelle organeller i en proces i flere trin, der involverer lysosomal nedbrydning for i sidste ende at genoprette den cellulære homøostase (Kenific og Debnath, 2015). Som sådan kan deregulering af autofagiflowet føre til kræft, da genanvendelse af makromolekyler, ikke-funktionelle organeller og proteiner giver kræftceller høje metaboliske krav til celleproliferation (Kenific og Debnath, 2015; García-Castillo et al., 2017). I dette scenarie er autofagi blevet et attraktivt terapeutisk mål, og AA’er kan muligvis være i stand til at hæmme denne proces. Liu et al. (2012) rapporterede, at forbindelsen AA005 (en acetogeninanalog) hæmmede ATP-produktionen, aktiverede AMPK og blokerede mTOR Complex 1-vejen for endelig at inducere autofagi i tarmkræftceller og for at standse cellecyklusen i G1-fasen. Denne forbindelse er en efterligning af AA’erne, hvor en ethylenglycoletherenhed erstatter de to THF-ringe. En sådan kemisk modalitet giver en overlegen biologisk aktivitet, et eksempel på AA’ernes plasticitet, der kan betragtes som inspiration til at skabe nye og mere kraftfulde molekyler med forskellige farmakologiske mål.

Antitumoraktivitet af acetogeniner i dyremodeller

Dataene vedrørende anticanceraktiviteten af AA’er og Annona-ekstrakterne er særligt lovende, da disse forbindelser udviste antitumoraktivitet i dyremodeller. Undersøgelser in vivo giver vigtige oplysninger om lægemidlets ydeevne i en hel organisme og gør det muligt at evaluere ikke blot deres antitumorvirkning, men også deres toksicitet i forskellige organer. Det er vigtigt, at dyrene er forsøgspersoner, der gør det muligt at foretage klinisk opfølgning, herunder vurdering af kliniske resultater, sygdomsfri progression og overlevelse samt sygdomsrecidiv.

Etylacetatekstraktet af A. squamosa, der er rig på AA’erne 12,15-cis-squamostatin-A (4) og bullatacin (5), reducerede tumorvæksten af hepatocellulære tumorer hos mus med en maksimal hæmningsgrad på 69,55 % i forhold til den positive kontrol (cyclophosphamid) (Chen et al, 2012b). Det blev foreslået, at cis-konfigurationen i en af komponenterne kunne være ansvarlig for den cytotoksiske aktivitet af urtepræparatet. Desuden reducerede bullatacin (5) isoleret fra A. squamosa i en dosis på 15 μg/kg effektivt tumorvækst i mus med S180- og HepS xenografts med henholdsvis 65,8 og 63,4 %. Disse resultater er bedre end dem, der blev opnået ved anvendelse af højere koncentrationer af taxol (40 μg/kg). Bullatacin (5) besidder en tilstødende bis-THF-enhed og tre hydroxygrupper, som sandsynligvis udgør den bioaktive struktur (Chen et al., 2012a).

Frøolien af A. squamosa hæmmede 53,54 % af tumorvæksten i mus, der bærer H22-celler (Chen et al., 2016) og reducerede ekspressionen af IL-6, Jak og forskellige fosforylerede signaltransducere og aktivatorer af transkriptionen p-Stat3-vejen. Det blev også rapporteret, at de α, β-umættede γ-lactoneenheder, der er til stede i AA’er, er Michael-reaktionsacceptorer (Ji et al., 2012), som hæmmer Stat3-aktivering, et terapeutisk mål, der er involveret i celleproliferation, apoptose, inflammation og angiogenese (Cafferkey og Chau, 2016). Ekstraktet af A. muricata bremsede tumorvækst i xenografts af bugspytkirtel (Yiallouris et al., 2018), reducerer metastase ved at mindske niveauerne af metalloproteinase-9 og fremmer kræftcelledød gennem nekrose (Torres et al., 2012). I en xenograft af prostata forbedrede A. muricata-ekstraktet beriget med flavonoider biotilgængeligheden og viste lavere toksicitet end ekstraktet beriget med AA’er (Yang et al., 2015).

Laherradurin (6) og cherimolin-2 (7) blev isoleret fra lægeplanten A. diversifolia og testet in vivo mod cervikal- og kolorektalcancerceller (Schlie-Guzmán et al., 2009). Begge AA’er reducerede størrelsen af HeLa-tumorer med lignende værdier som doxorubicin; begge forbindelser udviste også antiproliferativ aktivitet in vitro mod den samme kræftcellelinje. Disse resultater er i overensstemmelse med andre rapporter, hvor det mest aktive molekyle blev rapporteret at være laherradurin (6), som besidder tilstødende bis-THF-enheder og en β-hydroxy-γ-methyl-γ-lactonstruktur, mens cherimolin-2 (7), som indeholder en ikke-tilstødende bis-THF-enhed og en γ-lactoneenhed, udviser en reduceret antitumoraktivitet. Tabel 2 viser de forskellige AA’ers antitumoraktiviteter i dyremodeller.

Toksicitetsundersøgelser

Dyreforsøg bør omfatte akut oral toksicitetsprotokoller for at teste kemikalier og observere tegn på toksicitet; disse minimerer det nødvendige antal dyr, sikrer en korrekt dosisadministration i forsøgene og undgår lidelser (OECD, 2008). Indtil nu er der imidlertid kun få oplysninger om toksiciteten af AA’er eller Annona-ekstrakter. F.eks. var LD50 for ethanolekstrakt af A. muricata i mus 1,67 g/kg ifølge Sousa et al. (2010). Arthur et al. (2011) rapporterede LD50 (<5 g/kg) for det vandige ekstrakt og noterede, at en højere dosis kan skade nyrerne. Det blev også observeret, at frøekstraktet af A. squamosa kunne forårsage leverskader (Miao et al., 2016b), og A. muricata-ekstraktet beriget med flavonoider udviste reduceret toksicitet i en xenograft af en prostata (Yang et al., 2015). Cherimolin-2 isoleret fra A. diversifolia udviste toksiske virkninger og død i SW480 xenografts i doser over 5 mg/kg/dag (Schlie-Guzmán et al., 2009).

Som forklaret tidligere kan AA’er hæmme kompleks 1 i respirationskæden gennem elektronkædetransporten i mitokondrierne. AA’erne slutter sig til og blokerer NADH-enzymet, som normalt er overudtrykt i kræftceller, hvilket hæmmer ATP-produktionen, hvilket i sidste ende fører til celledød. Formentlig tyder en sådan mekanisme på, at AA’erne er “uskadelige” for normale celler; der bør dog stadig udføres flere undersøgelser for at sikre disse molekylers selektivitet.

Slutning

Kemoterapi er ikke specifik for kræftceller; den forårsager flere uønskede bivirkninger som f.eks. skader på normale væv og organer. Det vigtigste aspekt af konventionel kemoterapi er imidlertid, at kræftceller i et betydeligt antal tilfælde udvikler resistensmekanismer, der muliggør tumorfremskridt og metastase.

Søgningen efter nye lægemidler i naturen er ikke ny. Adskillige derivater af naturlige stoffer anvendes i øjeblikket til behandling af forskellige sygdomme. For eksempel anses taxol (paclitaxel), som blev opdaget ved hjælp af traditionel viden, for at være den mest indbringende kræftbehandling på markedet. Det er interessant, at paclitaxel er et antimitotisk lægemiddel, der hæmmer celleproliferation i cellekulturer, men i tumorer er det dokumenteret, at det fremkalder multipolære delinger, hvilket viser, hvordan et molekyle kan have forskellige virkningsmekanismer afhængigt af in vitro- eller patientforhold. Denne alkaloid har 30 års historie og illustrerer de vigtigste hindringer for arbejdet med naturprodukter, deres begrænsede biologiske tilgængelighed og produktionsomkostningerne, men også den utrolige effektivitet, der dræber kræftceller.

Acetogeniner er alsidige anticancermolekyler, der forårsager tumorcelledød ved forskellige mekanismer. De kan modulere udelukkelsen af kemoterapeutiske lægemidler fra kræftceller og er stærke apoptoseinducerende stoffer. Deres bioaktive fleksibilitet afspejles i deres evne til at regulere cellecyklusen ved at standse cellerne i fase G1, fremme apoptose ved at hæmme forskellige proteiner og endda inducere autofagi. Desuden skiller de sig ud ved deres metaboliske interaktioner, der specifikt er relateret til transkriptionsfaktorerne HIF1 og STAT3, og deres konsekvenser for energiforbrug, angiogenese, inflammation og metastase. AA’ernes antitumoraktivitet in vivo er lovende (bullatacin, laherradurin og cherimolin-2 er eksempler herpå). De prækliniske data er imidlertid ikke tilstrækkelige til at opnå en god forståelse af AA’ernes farmakodynamik og kinetik, og der er behov for flere akutte toksicitets- og opløselighedstests for at garantere sikkerheden og muligheden for kliniske forsøg med mennesker. Desuden kunne inkorporering af forskellige ligander (dvs. antistoffer, vitaminer og peptider) eller fremstilling af tumorspecifikke derivater forbedre AA-aktiviteten og give mere egnede lægemidler.

Planteekstrakter er kemisk komplekse, og deres helbredende egenskaber afhænger ofte af interaktionerne mellem forbindelserne og deres proportioner i ekstraktet. Der er stadig meget at opdage med hensyn til AA’ernes indvirkning på kræft. Dette område giver mulighed for at finde nye molekyler til behandling af denne komplekse sygdom. Standardisering af ekstrakter er derfor et muligt alternativ til anvendelse af urtetilskud, især i planter, hvor de farmakologiske aktiviteter er baseret på kombinationen af mere end én forbindelse. Denne mini-review indeholder en liste over nogle tidligere undersøgte AA’er, der udviser antitumoraktivitet og kunne have en fremtid i klinisk kræftforskning.

Author Contributions

NJ-H bidrog til udformning, skrivning og diskussion af artiklen; CP-P bidrog væsentligt til diskussion og revision af manuskriptet; VC-T forberedte alle figurer og tabeller; MM-V og AG-E bidrog til artiklens kemiske afsnit; AZ-D bidrog væsentligt til diskussionen af artiklens molekylærbiologiske del. Alle forfattere diskuterede, reviderede og godkendte den endelige version af manuskriptet til offentliggørelse.

Funding

Dette arbejde blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Mexico (bevilling nummer 285884). VC-T blev finansieret af CONACYT (ph.d.-stipendium nummer 267787).

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i fravær af kommercielle eller økonomiske relationer, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Anerkendelser

NJ-H takker CONACYT for finansiering af projektet.