1.1 De mulige fysiologiske kilder til nukleotider og nukleosider
ATP og andre beskrevne nukleotider behandler både metabotropiske (P2Y) og ionotrofiske (P2X) receptorer. P2X-receptorunderenheder (P2X1-P2X7) danner ligand-gated kationkanaler, som homomultimere eller heteromultimere. P2X3-underenhederne bidrager til ionpermeabilitetsvejen ved at sammenføje felterne af hver underenhed. P2X3R har den laveste registrerede relative Ca2+-permeabilitet af familien. P2X7 er ud over kationkanaler forbundet med at indeholde store cytolytiske porer, som findes i makrofager og mikrogliaceller i hjernen. P2Y-receptorer kan aktivere eller hæmme adenylatcyklase afhængigt af subtypen og dermed af typen af koblet G-protein. Adenylatcyklase og især for Ca2+-kanalhæmning forekommer. P2Y-receptorer udgør som undergruppe af G-protein-koblede receptorer; de fleste kobler sig til fosfolipase C via G-proteinet, men der forekommer også hæmning af adenylatcyklase og N-type Ca2+-kanaler og aktivering af K+-kanaler. De udtrykte P2Y-receptorer adskiller sig generelt farmakologisk ved rangordenen af agonisterne; nogle foretrækker pyrimidin frem for purin. Flere P2Y-receptorer har en meget almindelig vævsfordeling . Molekylære strukturer af ATP og BzATP er vist i figur 1.
Figur 1.
Molekylære strukturer af ATP og BzATP .
Adeninnukleotider hæmmer isoproterenol- og forskolin-induceret cyklisk AMP-akkumulering i C6-2B gliomceller fra rotte. Denne hæmning sker i tilstedeværelse af en fosfodiesteraseinhibitor. Adeninnukleotider forårsagede ingen virkninger ved målinger af den direkte fosfodiesteraseaktivitet i intakte celler. Forbehandling af C6-2B-gliomceller med pertussis-toksin blokerer de hæmmende virkninger af P2Y-purinerge receptoragonister. En række ATP- og ADP-analoger gav en rangorden af potens (2-methylthioadenosin 5′-triphosphat> eller = 2-methylthioadenosin 5′-diphosphat > adenosin 5′-O-(2-thiodiphosphat) > 2-chlor-adenosin ADP = adenosin 5′-O-(3-thio- triphosphat) > ATP > UTP), der forventes af en aktivering af en P2Y-purinerge receptor; og de P2X-purinerge receptoragonister alfa, beta-methylenadenosin 5′-triphosphat og beta, gamma-methylen-adenosin 5′-triphosphat havde ingen virkning. Fosfolipase C-aktivitet forekommer som reaktion på P2-purinerge receptoraktivering i mange målvæv, og derfor blev virkningerne af P2Y-receptoragonister på inositolphosphatakkumulering målt i C6-2B-celler. Der blev ikke fundet beviser for en regulering af P2Y-purinerge receptorer medieret af inositollipidmetabolismen under forhold, hvor aktivering af muscarin-kolinerge receptorer eller AIF4 øgede inositolphosphat-akkumulationen. Disse resultater tyder på, at der findes en P2-purinerge receptorsubtype med forskellige signaleringskarakteristika på C6-2B rottegliomceller. Selv om denne receptor udtrykker de generelle farmakologiske egenskaber for en fosfolipase C-bundet P2Y-purinerge receptor, kan den repræsentere en unik receptorsubtype, fordi den hæmmer adenylylcyklase .
Puriner blev anset for at være begrænset til det intracellulære rum, hvor de blev brugt til energiprocessering, nukleinsyresyntese og et stort antal biokemiske reaktioner. Karl Lohmann isolerede ATP, som er den vigtigste intracellulære energiværdi, i 1929 . Adenosin og adenosintrifosfat (i) er imidlertid rigelige biokemiske komponenter i tumormikromiljøet, (ii) er stærke modulatorer af immuncellesvar og cytokinfrigivelse og (iii) er vigtige aktører i interaktionen mellem vært og tumor. Desuden påvirker begge nukleotider direkte tumorcellers vækst. Adenosin er et stærkt immunosuppressivt middel (hovedsagelig effektivt ved A2A-receptorer) og en cellevækstmodulator (hovedsagelig effektivt ved A3-receptorer). ATP er et proinflammatorisk middel (effektivt ved P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6 og P2Y12 og ved P2X4- og P2X7-receptorer), et immunosuppressivt middel (effektivt ved P2Y11) og en vækstfremmende faktor (effektivt ved P2Y1, P2Y2 og P2X7). Dette komplekse signalnetværk producerer en række hæmmende og stimulerende reaktioner, der påvirker immuncellefunktion, tumorvækst og metastatisk spredning.
Purinerge receptorer, der er repræsenteret af mange familier, er de hyppigst forekommende receptorer i levende organismer og optræder muligvis i de tidlige stadier af evolutionen. Purinerg signalering i perifere og centrale nervesystemer er et hurtigt voksende område. Undersøgelse af disse receptorer gør det muligt at udvikle terapeutiske strategier for disse lidelser med nye virkningsmekanismer, herunder purinergiske, patogene tilstande, herunder smerte, traumer, iskæmi, epilepsi, migræne, psykiatriske lidelser og lægemiddelafhængighed .
I mikromolære/nanomolære koncentrationer har ekstracellulært adenosintrifosfat (ATP) vist sig at producere betydelige funktionelle ændringer i en lang række normale og transformerede celletyper. Selv om ATP specifikt kan frigives fra cytosolen i beskadigede celler, er det også pakket i nogle exocytotiske vesikler/granula, der indeholder konventionelle neurotransmittere og hormoner. Forskellige biologiske reaktioner på ATP formidles af forskellige P2-purinerge celleoverfladereceptorer, der aktiveres ved binding af ATP og andre nukleotider. Nylige fysiologiske, biokemiske og farmakologiske undersøgelser har vist, at der findes flere typer af ATP-receptorsubtyper. Disse omfatter: (1) G-proteinbundne ATP-receptorer, der inducerer inositolphospholipidhydrolyse, Ca2 +-mobilisering og aktivering af proteinkinase C; (2) ATP-receptorer, der direkte aktiverer ikke-selektive kationkanaler i plasmamembraner i forskellige celletyper og (3) ATP-receptorer, der er i stand til at fremkalde cytotoksiske eller aktiveringsreaktioner i T-lymfocytter og andre immune effektorceller ved hurtig induktion af overflademembranporer, der er permeable for ioner og endogene metabolitter (med molekylvægte på op til 900 Da). Ud over disse funktionelle kriterier kan disse standard ATP-receptor-subtyper adskilles farmakologisk ved karakteristisk potens for forskellige strukturelt modificerede ATP-analoger.
Intracellulære nukleotider spiller en grundlæggende og allestedsnærværende rolle i energimetabolismen, nukleinsyresyntesen og enzymreguleringen. Det er almindeligt kendt, at ekstracellulære nukleotider og nukleosider udøver vigtige biologiske virkninger i mange væv og celler . GLUTs (letter transporten af glukose ind i cellerne), SGLTs (letter reabsorptionen af glukose tilbage i kredsløbet) og KATP (ATP-følsomme kaliumkanaler) metaboliske sensorer spiller en vigtig rolle i glukosehomeostase og -metabolisme i kroppen og i mange specifikke organer (f.eks, tarm, bugspytkirtel, hjerte, skeletmuskulatur og hjerne) .
KATP binder metaboliske signaler til cellernes excitabilitet og spiller en vigtig rolle i mange væv, herunder regulering af insulinudskillelse, kontrol af vaskulær tone og beskyttelse af neuroner og muskler mod iskæmi. KATP-kanaler er oktameriske komplekser bestående af fire sulfonylurinstofreceptorer (SUR.x) og fire indadrettet ensrettende kaliumkanaler (Kir6.x). De reguleres af intracellulær ATP og ADP. Mens ATP hæmmer kanalaktiviteten, modvirker ADP den hæmmende virkning af ATP i tilstedeværelse af Mg2+ og stimulerer kanalaktiviteten. Disse gate-egenskaber er afgørende for, at denne kanal kan registrere metaboliske ændringer i cellerne. I pancreatiske β-celler stiger /-forholdet således som reaktion på, at blodglukoseniveauet øges, hvilket fører til lukning af KATP-kanalen, membrandepolarisering, aktivering af spændingsafhængige Ca2+-kanaler og insulinfrigivelse. Når blodglukoseniveauet er lavt, falder /-forholdet imidlertid, KATP-kanalerne åbnes, og insulinsekretionen falder .
De katastrofale kanaler i bugspytkirtlen aktiveres som følger; i tilfælde af at β-cellens glukoseniveau øges, øges det intracellulære forhold mellem ATP og ADP også, hvilket fører til lukning af KATP-kanalen, depolarisering af cellerne og insulinfrigivelse .
Den P-følsomme K′(K + ) strøm menes at blive reguleret af GTP-bindende proteiner (G-proteiner), men de veje, der kombinerer receptor, G-protein og kanal, er ikke identificeret. Reguleringen af tolbutamidfølsom K′-strøm i neonatale rotteventrikulære myocytter er bestemt. Aktiverede ATP-følsomme K + (K + ) kanaler er til stede i cellerne, når det intracellulære ATP-niveau falder. Intracellulære ATP-niveauer findes, når de intracellulære ATP-niveauer reduceres i cellen, intracellulær skeletmuskel, hjerne og bugspytkirtel. Der vides kun lidt om K + -kanalernes funktion i hjerteceller, selv om deres vigtige rolle i kontrollen af insulinudskillelsen fra pancreatiske P-celler er veletableret. Når disse kanaler aktiveres farmakologisk, reducerer de i høj grad aktionspotentialets varighed, og det er blevet foreslået, at de er ansvarlige for afkortningen af aktionspotentialet i metabolisk farlige iskæmiske muskler. ATP-koncentrationen i den metabolisk blokerede kaste forbliver imidlertid over det niveau, som forhindrer kanalerne i de udskårne membranpletter. En mulig forklaring på denne uoverensstemmelse er, at kanalernes ATP-følsomhed kan moduleres af intracellulære mekanismer .
ATP-responsive K+-kanaler, kaldet KATP-kanaler, udgør en forbindelse mellem det cellulære stofskifte og membranens elektriske aktivitet i forskellige væv. Kanalisoformer er mål for forbindelser, der stimulerer og hæmmer deres aktivitet, hvilket resulterer i henholdsvis hyperpolarisering og depolarisering af membranen. Vaskulær glat muskulatur og stimulering af insulinsekretion løsningen er eksempler for disse situationer ovenfor . Adenosinagonister og åbnere af den ATP-følsomme kaliumkanal (KATP) er blevet rapporteret til at begrænse infarktstørrelsen (IS) . ATP-følsomme kaliumkanaler (KATP) er veldefinerede i hjertet, skelet og glat muskulatur, pancreasceller, hypofysen samt det centrale og perifere nervesystem, både elektrofysiologisk og farmakologisk. Aktiviteterne og dermed de forskellige cellulære funktioner styres af det cellulære stofskifte. Generelt menes ændringerne i ATP (som forårsager kanallukning) og i MgADP (som aktiverer kanalen) at have en dobbelt metabolisme med hensyn til kanalaktivitet 6. Det er beskrevet, at den cellulære lokalisering af to mRNA-transskriptioner, der forventes at generere ATP-følsomme K+-kanaler i murinhjerne, er beskrevet. Der er beviser for, at KATP-kanalen i bugspytkirtelceller består af en Kir6.2 og et kompleks af SUR1-underenheder. KATP-kanaler med lignende karakteristika (type I) er blevet beskrevet i forskellige neuroner, bl.a. i hjernebark, basisk nigra, caudate og hippocampus .
Næsten alle tumorceller og alle immunceller udtrykker plasmamembranreceptorer for ekstracellulære nukleosider (adenosin) og nukleotider (ATP, ADP, UTP, UDP og sukker-UDP). Tumormikromiljøet er kendetegnet ved en usædvanlig høj koncentration af ATP og adenosin. Adenosin er en vigtig determinant for det immunosuppressive tumormiljø. Seriel hydrolyse af ekstracellulær ATP, der katalyseres af CD39 og CD73, er den vigtigste vej til dannelse af adenosin i tumorinterstitium. Ekstracellulær ATP og adenosinform er både værts- og tumorreaktioner. Afhængigt af den aktiverede specifikke receptor formidler ekstracellulære puriner immunosuppression eller immunstimulering på værtssiden og vækststimulering eller cytotoksicitet på tumorsiden. Den seneste udvikling på dette område giver nøglen til at tyde dette komplekse scenarie ved hjælp af de potentielle fordele ved terapi. Prækliniske data tyder på, at målretning af den adenosinproducerende vej eller adenosinerge receptorer dæmper immunosuppressionen og hæmmer tumorvæksten kraftigt. På den anden side hæmmes væksten af eksperimentelle tumorer kraftigt ved at målrette receptoren for P2X7 ATP-selektiv kræft- og immunceller. Den rolle, som ekstracellulære puriner (purinerg signalering) spiller i interaktionen mellem vært og tumor, og fremhæver nye behandlingsmuligheder fra de seneste fremskridt. Der er nu enighed om, at ATP og adenin er de vigtigste komponenter i tumormikromiljøet (TME), hvor TME påvirker tumorvækst, immuncellefunktioner og interaktion mellem tumor og vært på forskellige måder. I lyset af den udbredte observation af, at mange maligne tumorer overudtrykker flere P1R- eller P2R-subtyper, ville en simpel fremgangsmåde kræve, at man målretter disse receptorer med selektive receptorer for at undertrykke tumorreceptorvækst. På samme linje ses de enzymer, der er involveret i metabolismen af ekstracellulære nukleotider og nukleosider (CD39, CD73 og adenosindeaminase). Selv om effektiviteten af flere enkle prækliniske modeller er blevet bevist, er denne enkle fremgangsmåde tydeligvis meget renkulturel. P1R’er, P2R’er og ATP/adenosinforstyrrende enzymer udtrykkes sammen med værtens immunstimulerende og stromale celler, som har meget vigtige funktioner for værtens integrerede kompleksdannelse omkring tumoren. En omhyggelig udvælgelse af den purinerge receptorkandidat i kombination med modulatorer af ekstracellulære adenosinerge veje kan muliggøre hæmning af tumorcellers vækst og samtidig øge værtens anti-tumorrespons. Dette middel mod kræft vil give et yderligere effektivt våben til kombinationsbehandlinger.
Nucleotider og deres receptorer er ved at blive potentielle aktører i interaktionen mellem vært og tumor, som f.eks. nye og vigtige inflammatoriske og immunmodulerende stoffer. Et stort antal P2- og P1-receptorer, der udtrykkes af tumor- og inflammatoriske celler, der udviser forskellige ligandaffiniteter for P2- og P1-receptorsubtyper, moduleres af lokale faktorer, der er opnået fra ektonukleotider og ADA på nukleotid- og adenosinkoncentrationen. In vivo data understøtter in vitro beviser for, at reduktionen af adenosinkoncentrationen i tumoren og målretning af P2X7-receptoren har en potent antitumorvirkning. Derfor åbner undersøgelse af purinerg signalering i kræft lovende perspektiver for udvikling af innovative terapeutika .
Purinerg signalering har været fokuseret på det tumorassocierede immunforsvar; nukleotider og nukleosider har stærke direkte virkninger på selve tumorcellerne. Stimulering af P2Y-receptorer (P2Y1 og P2Y2) fremmer vækst, og derfor er det sandsynligt, at akkumulering af ATP i tumormikromiljøet, afhængigt af de udtrykte P2Y-receptorsubtyper, vil fremme tumorvækst. Ud over P2Y-receptorer spiller P2X7 en rolle for tumorvækst. Det er en gammel observation, at de fleste maligne tumorer overudtrykker P2X7 . Det er kendt, at denne receptor formidler et stærkt cytotoksisk respons . Det er derfor uvist, hvorfor en tumor skulle overudtrykke en “selvmordsreceptor”. Cytotoksicitet udløses imidlertid oftest af farmakologiske (dvs. nær millimolære) ATP-doser. I modsætning hertil giver aktivering af P2X7 ved endogent frigivet ATP en trofisk, vækstfremmende effekt.
Nukleotider og nukleosider i luftvejsoverfladen regulerer den mucociliære clearance-aktivitet (MCC), som er den primære naturlige forsvarsmekanisme, der fjerner fremmedlegemer og patogener fra luftvejsoverfladen. Disse virkninger i luftvejene formidles hovedsagelig af to purinerge receptorsubtyper, den Gq-koblede ATP/UTP-sensorerende P2Y2-receptor og den Gs-konjugerede A2b adenosinreceptor. Aktivering af A2b-receptoren resulterer i cyklisk AMP-afhængig aktivering af Cın1-kanalen i cystisk fibrose transmembranregulatoren (CFTR) og stimulering af den ciliære pulsfrekvens. Agonist-aktivering af P2Y2-receptoren fremmer hæmning af CFTR-afhængig og CFTR-uafhængig Cl-sekretion, ciliær slagtilfælde og mucin-sekretion samt Na+ absorption .
Fænomenet om processen afslører deltagelse af en biologisk kaskade. I denne forbindelse efterligner adenosinagonister og ATP-følsomme K+ -kanal (KATP)-åbnere nogle beskyttende virkninger af prækonditioneringsprocessen. Desuden ophæves disse virkninger af adenosinantagonister og KATP-blokkere; dette tyder på, at frigivelse af adenosin og aktivering af KATP-kanaler gennem adenosin-Al-receptorer kan udgøre et tidligt trin i iskæmisk cerebral prækonditionering .
Aktivering af adenosinreceptor, proteinkinase C (PKC) og ATP-følsomme kaliumkanaler (KATP) er kendt for at udløse prækonditionering. Dataene giver direkte beviser for, at KATP-kanalen snarere end adenosinreceptoren er effektoren nedstrøms PKC ved initiering af PKC-medieret prækonditionering. Både adenosinreceptoren og KATP-kanalen er nødvendige for at fremme den egentlige beskyttende virkning under kontinuerlig hypoxi . Muligheden for at forene den biologiske fase af den beskyttende begivenheds involvering af adenosin A1-receptorer og KATP-kanaler, der er forbundet med krydstolerance mellem KA-induceret epileptisk tolerance eller KA-induceret epilepsi og global iskæmi, er evalueret .