Genetiske polymorfismer af cytokrom P 450 2D6 (CYP2D6): kliniske konsekvenser, evolutionære aspekter og funktionel diversitet

Pharmakogenetik, der beskæftiger sig med arvelige forskelle i lægemiddelmål og lægemiddeldisposition i form af lægemiddelreceptorer og lægemiddeltransportører, er i hastig udvikling.1, 2, 3, 4, 5 På nuværende tidspunkt er vores viden mest avanceret med hensyn til indflydelsen af polymorfisk fordelte gener, der koder for lægemiddelmetaboliserende enzymer, selv om viden om lægemiddelreceptorer og -transportører vokser hurtigt. Den største betydning for de interindividuelle forskelle i lægemiddelresponsen på nuværende tidspunkt udøves af forskelle i lægemiddelmetabolismekapacitet forårsaget af genetisk polymorfi eller af hæmning eller induktion af lægemiddelmetabolisme. Ud over interaktioner mellem lægemidler, patofysiologiske faktorer og miljøfaktorer spiller genetikken af de lægemiddelmetaboliserende enzymer en afgørende rolle for forståelsen af interindividuelle forskelle i lægemiddelrespons og bivirkninger ved lægemidler. Den største indvirkning blandt de lægemiddelmetaboliserende enzymer udøves af cytokromerne P450, som er de vigtigste fase I-enzymer.6, 7 Blandt disse er CYP2C9, CYP2C19 og CYP2D6 meget polymorfe og tegner sig tilsammen for ca. 40 % af den hepatiske fase I-metabolisme hos mennesker. Desuden bidrager polymorfismer af CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 og CYP2C8 også til interindividuelle forskelle i lægemiddelmetabolismen. CYP2D6 er måske det mest omfattende undersøgte polymorfisk udtrykte lægemiddelmetaboliserende enzym hos mennesker; dets polymorfi har stor klinisk betydning og var det første af de polymorfe P450’er, der blev karakteriseret på molekylært niveau. I dag er der identificeret mere end 48 forskellige lægemiddelsubstrater for dette enzym (tabel 1), og CYP2D6 er ansvarlig for ca. 25 % af metabolismen af kendte lægemidler. Dette kan dog være en lille overvurdering, da man tidligere specifikt har søgt efter lægemidler, der metaboliseres af dette enzym, på grund af dets polymorfe udtryk. I denne gennemgang beskrives den aktuelle viden om og konsekvenserne af CYP2D6’s molekylærgenetik samt viden om virkningen på lægemiddelbehandlingen.

Generelle karakteristika for CYP2D6

CYP2D6 er et polypeptid på 497 aminosyrer. Enzymet udgør kun en lille procentdel af alle hepatiske P450’er, men dets rolle i lægemiddelmetabolismen er langt større end dets relative indhold (se Zanger et al8). De forskellige modeller af enzymet baseret på den tredimensionelle struktur af cytokrom P450 BM-3 eller CYP2C5 og resultaterne fra stedbestemt mutagenese adskiller sig meget fra hinanden. På trods af succesen med godt diffrakterende krystaller af pattedyrs CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 og CYP3A4 har ingen endnu været i stand til at opnå gode CYP2D6-krystaller. Man mener, at sådanne krystaller er nødvendige for at få en skabelon til modeller, der har tilstrækkelig opløsning og nøjagtighed til f.eks. at kunne forudsige lægemidler, der vil være substrater for dette enzym. En sådan model ville være af stor betydning for lægemiddelindustrien, fordi det er afgørende for et vellykket produkt på markedet, at man ved lægemiddeldesign undgår stoffer, der er høj-affinitetssubrater for CYP2D6.

CYP2D6-substrater er lipofile baser med et protonerbart nitrogenatom. Hydroxyleringsreaktionen finder sted i en afstand på 5 eller 7 Å fra nitrogenatomet. Stedbestemte mutageneseeksperimenter viser, at Asp301 er den negativt ladede aminosyre, der er ansvarlig for bindingen til substratets nitrogenatom8 . Desuden synes også Ser304, Thr309 og Val370 at være involveret i substratbindingen9 , selv om der er behov for yderligere modeller til bekræftelse.

CYP2D6 har en meget høj affinitet for alkaloider (se tabel 1).10 Enzymekspressionen er i modsætning til andre hepatiske xenobiotika-metaboliserende cytochrom P450’er ikke reguleret af nogen kendt miljøaktivitet og er ikke inducerbar af kendte hormoner. Da der ikke er beskrevet nogen fænotype hos personer, der mangler CYP2D6 eller har op til 13 aktive genkopier, kan man konkludere, at enzymet ikke har nogen vigtig endogen funktion. Der er blevet foreslået en rolle for metabolismen af nogle neurotransmittorer. Der er således for nylig fremlagt beviser for, at CYP2D6 er en specifik 5-methoxyindolethylamin O-demethylase11 , og også 5-methoxytryptamin12 er blevet vist at være et substrat. Ud over sådanne substrater er det sandsynligt, at enzymet spiller en vigtig rolle for metabolismen af fødevarebestanddele, navnlig alkaloider (se nedenfor)

CYP2D6’s virkning på substrater med potentiel aktivitet i hjernen ville indebære en funktionel fænotype på forsøgspersoner, dvs. dårlige metabolisere (PM’er), der mangler enzymet. Faktisk har to undersøgelser vist en signifikant sammenhæng mellem adfærd ved hjælp af psykologiske tests og tilstedeværelsen af CYP2D6.13, 14 Spørgsmålet opstår, om en sådan aktivitet er essentiel. Interessant nok har Pai et al.15 for nylig fremlagt beviser for, at en almindelig variant af pseudogenet CYP2D7P kan udtrykkes i en aktiv form i den menneskelige hjerne, hvilket giver et funktionelt enzymprodukt, der er aktivt i metabolismen af f.eks. kodein. Hvorvidt dette repræsenterer et produkt af ægte funktionel betydning skal endnu ikke afklares, selv om fundet som sådan er af interesse.

CYP2D6-polymorfi – historiske aspekter

Polymorfi af CYP2D6 blev uafhængigt af hinanden opdaget i tre forskellige laboratorier. Folke Sjöqvists laboratorium viste, at metabolismen af nortriptylin og desimipramin, som senere viste sig at være CYP2D6-substrater, udviste en enorm interindividuel variation i plasmaniveauer ved samme dosis, og der blev identificeret to fænotyper.16 Efterfølgende undersøgelser foretaget af Sjöqvist-gruppen ved hjælp af tvillinger viste, at forskellen var genetisk betinget. Bob Smith og medarbejdere i London undersøgte metabolismen af to antihypersensitive lægemidler bethanidin og debrisoquin, som blev brugt mod hypertension. Da Bob Smith i maj 1975 indtog 40 mg debrisoquin, blev han svimmel, besvimede og led af alvorlig hypotension. En efterfølgende undersøgelse med 10 mg debrisoquin hos 94 forsøgspersoner identificerede de to fænotyper.17 Michel Eichelbaum i Bonn undersøgte de antiarytmiske virkninger af spartein, og to forsøgspersoner klagede over ubehagelige bivirkninger som sløret syn, diploida, svimmelhed og hovedpine. Analyse af plasmaniveauerne viste, at de havde 4-5 gange højere niveauer end de andre, og de to fænotyper blev offentliggjort i 1978 og 1979.18, 19

Det genetiske grundlag bag debrisoquin-polymorfismen blev opklaret 10-15 år senere. I en samarbejdsundersøgelse mellem Urs Meyers og Frank Gonzalez’ laboratorier blev polyklonale CYP2D-antistoffer fra rotter udviklet i Basel anvendt som redskaber til at klone det humane CYP2D6 cDNA fra et cDNA-bibliotek fra menneskelig lever λgt 11, og det udtrykte cDNA havde den forventede bufuralolhydroxylaseaktivitet20 . Ved hjælp af RFLP kunne Meyers laboratorium bekræfte ændrede RFLP-mønstre i PM’er for debrisoquin,21 mens den fuldstændige identifikation af CYP2D6*3- og CYP2D6*4-allelerne blev offentliggjort i 1990.22

I slutningen af 1980’erne identificerede vi i et frugtbart samarbejde med Leif Bertilsson og Folke Sjöqvist et RFLP-mønster hos kinesere, der er aktivt i CYP2D6-metabolismen, og som indikerer PM’er hos kaukasiere23 , og senere karakteriserede vi den mest almindelige delvist defekte CYP2D6-allel hos orientalere, CYP2D6*10.24 Da en fransk gruppe modsatte sig vores størrelsesidentifikation af de kinesiske XbaI-fragmenter, og vi gen-screenede flere forskellige DNA-prøver ved XbaI RFLP ved hjælp af en lavere tæthed af agarosegelen og fandt nogle prøver, som vi troede havde usplejset DNA (se Ingelman-Sundberg25 for yderligere detaljer). Undersøgelse af deres oprindelse afslørede imidlertid, at de kom fra personer, der var meget hurtige til debrisoquinmetabolisme, og der blev identificeret personer med op til 12 ekstra CYP2D6-genkopier. Dette viste sig at være den første beskrivelse af et stabilt forstærket aktivt gen hos mennesker26 , og betegnelsen ultrarapide metabolisere (UM’er) blev defineret.27 Senere undersøgelser af hyppigheden i forskellige befolkninger viste, at der er 30 % hos etiopiere28 , 10 % hos spaniere og 10 % af befolkningerne i Italien og Tyrkiet, mens UM’er er ualmindelige (1-2 %) i Nordeuropa og stort set fraværende i Asien (se6 for referencer). Hos etiopiere fandt vi ingen individer, der var homozygote for defekte CYP2D6-gener, men alleler, der indeholdt 2, 3, 4 såvel som 5 CYP2D6-genkopier.28 En lignende situation blev også set hos saudiarabere.29 En vurdering af antallet af personer, der bærer CYP2D6-gen-duplikeringer i Vesteuropa, viser, at 5,5 % af europæerne bærer mere end to aktive CYP2D6-genkopier og er UM’er (tabel 2).

CYP2D6 genetisk polymorfisme

CYP2D6-genet er lokaliseret på kromosom 22q13.1. Locus indeholder to tilstødende pseudogener, CYP2D7 og CYP2D8.30 Udviklingen af det humane CYP2D-lokus har medført eliminering af tre gener og inaktivering af to (CYP2D7P og CYP2D8P) og delvis inaktivering af et (CYP2D6). På nuværende tidspunkt er der kendskab til mere end 46 forskellige polymorfe CYP2D6-alleler. Tilstedeværelsen af de meget ensartede, tæt beliggende pseudogener, der bærer skadelige mutationer, har f.eks. gennem ulige krydsningsreaktioner ført til dannelsen af mange af de forskellige CYP2D6-alleler, som oftest koder for defekte genprodukter. “Aktiviteten” i CYP2D-lokusset er høj sammenlignet med f.eks. CYP2C-lokusset, og som følge heraf er der dannet mange variantalleler på relativt kort tid. De mest almindelige variantalleler fordelt på forskellige etniske grupper er anført i tabel 3, og alle variantalleler er præsenteret på hjemmesiden for udvalget for nomenklatur for menneskelige CYP-alleler (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). De alternative CYP2D6-alleler kan inddeles i kategorier, som forårsager afskaffet, nedsat, normal, øget eller kvalitativt ændret kataxlytisk aktivitet. Blandt de vigtigste varianter er CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 og CYP2D6*41.

Den mest almindelige allel hos asiater (allelfrekvens på >50 %) og dermed måske den mest almindelige CYP2D6-allel i verden er CYP2D6*10.24 CYP2D6.10-enzymet har en skadelig P34S-mutation, der ophæver den vigtige PPGP-sekvens, der er nødvendig for foldning af P450, og er derfor meget ustabil,24 men det har også en reduceret affinitet for substraterne.31 Blandt sorte er CYP2D6*17, der først blev beskrevet i 199632 , den vigtigste variant af CYP2D6-allelen. Den koder ud over de to missense-mutationer, der er set i CYP2D6*2, også for T107I, som tilsyneladende giver en ændret struktur på det aktive sted. Dette skaber en ændret substratspecificitet33 , hvilket er tydeligt in vitro33 , men også når personer med CYP2D6*17-genotypen fænotypes in vivo34 , 35 Generelt er CYP2D6.17-enzymets aktivitet lavere end vildtypenzymet.

CYP2D6*41 er en variant af CYP2D6*2 med -1584 C i stedet for G. Den er mindre udtrykt end den tilsvarende CYP2D6*2-allel (se Zanger et al36). Det er plausibelt, at -1584G>C er i linkage disequilibrium med en anden SNP, der forårsager mangelfuld splejsning af mRNA’et, selv om dette skal påvises eksplicit. Effekten in vivo af CYP2D6*41 er imidlertid ret udtalt, og forsøgspersoner homozygote for denne allel ligner fænotypisk individer med den intermediære fænotype (IM) med én mangelfuld CYP2D6-allel.36

Evolution af CYP2D-loci

Der er en drastisk forskel mellem gnavere og mennesker i antallet af aktive CYP2D-gener. Mens musen har ni forskellige aktive Cyp2d-gener37 , bærer mennesket kun et enkelt, som faktisk mangler hos 7 % af den kaukasiske befolkning (figur 1). CYP2D6-enzymet er kendt for at have en meget høj affinitet for plantetoksiner som f.eks. alkaloider.10 Det er rimeligt at antage, at musen har bevaret generne aktive på grund af et behov for et afgiftende potentiale i kosten, mens den mere begrænsede fødeindtagelse hos mennesker i fortiden, herunder den intellektuelle evne til at overføre information om passende føde mellem generationerne, har resulteret i et tab af et selektionspres, der har bevirket, at generne ikke er aktive.

CYP2D6-genet er ikke inducerbart i almindelig forstand gennem øget genekspression af ekspression af genproduktet. Hos Drosophila sker der selektiv udvælgelse af stammer, der lever i f.eks. området med Senita-kaktus, der udskiller giftige isokinolinalkaloider, og kun Drosophila mettleri, men ingen Drosophila melanogaster-stamme overlever i dette område, fordi deres evne til at inducere CYP6 og CYP28.38 En interessant genetisk udvælgelse sker også hos Drosophila, der er resistent over for insekticider. Fra 1930 til 1960 er der hurtigt udviklet insekticidresistente pletter. Interessant nok synes det molekylærgenetiske grundlag at være selektion for en indsættelse af et transposom (accord-element) i den 5′-regulerende region af Cyp6b-genet, der forårsager 40 til 100 gange højere ekspression af genproduktet.39 En anden mekanisme for erhvervelse af insekticidresistens hos Drosophila er eksemplificeret ved selektion for tre nøglemutationer i CYP6A2, dvs. R335S, L336V og V476L, der gør enzymet aktivt i forhold til metabolisme af DDT.40 En illustration af tre forskellige mekanismer for adaptiv respons over for substratstress er vist i figur 2.

Sådan har vi foreslået, at en sådan udvælgelse er sket for alleler, der bærer flere aktive CYP2D6-gener i Nordøstafrika. Grundlaget for denne udvælgelse ville være CYP2D6-enzymets evne til at detoxicere alkaloider, hvilket øger tilgængeligheden af potentielle fødevarer blandt bærere af flere CYP2D6-genkopier. Dette ville være meget gavnligt for overlevelsen i perioder med sult, når kun en brøkdel af populationen i denne region når modenhed. En undersøgelse af hastigheden af debrisoquinmetabolismen hos etiopiere, der bor i Etiopien, sammenlignet med etiopiere, der bor i Sverige, viste, at indfødte etiopiere af samme genotype var langsommere i deres metabolisme sammenlignet med etiopiere i Sverige, mens der ikke blev fundet nogen signifikante forskelle i hastigheden af CYP2C19-afhængige katalytiske reaktioner, som målt med S-mephenytoin41 . Dette kan fortolkes på den måde, at bestanddele i den etiopiske mad, formodentlig alkaloider, hæmmer CYP2D6-aktiviteten, og at sådanne komponenter faktisk kunne være en udløsende faktor for genetisk selektion. Vi foreslår, at den etiopiske befolkning ekspanderede for ca. 10 000-20 000 år siden i et sådant omfang, at fødevarerne udviste en vigtig begrænsning. I perioder med sult er der opstået et selektionspres, som har begunstiget overlevelsen af personer, der i højere grad er i stand til at afgifte plantetoksiner, hvilket har øget antallet af planter, der kan levere nyttig føde (figur 3). Dette skabte en ekspansion af subpopulationer med flere aktive CYP2D6-genkopier og også uden inaktive CYP2D6-gener. Da langt de mest almindelige varianter af CYP2D6-genet, der er duplikeret og multiduplikeret, er CYP2D6*2 og CYP2D6*41, der begge skaber to aminosyresubstitutioner i forhold til CYP2D6*1, kan det spekuleres, at substratspecificiteten hos denne form af enzymet er fordelagtig for metabolismen af visse planteprodukter. De efterfølgende folkevandringer fra Nordøstafrika til Middelhavsområdet resulterede i den høje frekvens af UM’er i Sydeuropa (jf. tabel 2).