Proteinekspression, oprensning og analyseprocedurer af hAASS-SDH
Vektor: pFB-LIC-Bse
Cellelinje: DH10Bac
Tags og tilføjelser: N-terminal, TEV protease-spaltbart hexahistidin-tag
Konstruere proteinsekvens:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(den understregede sekvens indeholder vektorkodet His-tag og TEV-protease-spaltningssted*)
Harvested cells were resuspended in lysis buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 20 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL pr. 1 mL proteaseinhibitorcocktail EDTA-fri).
Cellepellet blev opløst i ca. 200 mL lysisbuffer og brudt ved homogenisering ved 2 gennemløb ved 12.000 psi. Celleaffaldet blev pelleteret ved 35000 x g, 1 time, og supernatanten blev anvendt til oprensning på en gravitationsstrøm Ni-NTA-kolonne (5 mL).
De anvendte buffere er beskrevet nedenfor;
Bindingspuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 20 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Vaskbuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 40 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Vaskbuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 250 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Det afklarede celleekstrakt blev tilsat 5 ml Ni-NTA-harpiks, der var præ-equilibreret med lysisbuffer, og passeret gennem en glaskolonne. Kolonnen blev derefter vasket med bindingsbuffer (2 x 50 mL) og vaskebuffer (2 x 50 mL). Proteinet blev elueret med Elution Buffer i 5 x 5 mL fraktioner. De eluerede fraktioner fra kolonne 1 blev samlet og koncentreret til 5 mL med en 30 kDa MWCO-spinkoncentrator og injiceret i en S200 16/60-kolonne (præ-equilibreret i GF-buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% glycerol)) ved 1,0 mL/min. Der blev opsamlet 1,5 mL-fraktioner. Det eluerede protein blev spaltet natten over ved 4 °C med TEV-protease (1/20 (w/w)). Den følgende dag blev proteinprøven indlæst på en 0,5 ml Ni-sepharosekolonne, der var præ-equilibreret med GF-buffer for at fjerne ikke-spaltede proteiner. De sammenlagte proteinfraktioner blev koncentreret til 13 mg/mL ved hjælp af en 30 kDa mwco-koncentrator.
Aktivitetsassay og screening
Den SDH-aktivitet af hAASS blev målt ved at følge NAD+-reduktionen til NADH, idet det udnyttes, at den reducerede form af NADH er fluorescerende, når den exciteres med 340 nm lys. Vi overtog assayet i 384-well-format, med detektion ved hjælp af PheraStar fluorescenslæseren (BMG Labtech) (Excitation/Emission = 340/480 nm). Dette assay gav et lineært respons med en proteinkoncentration på op til 150 nM. En typisk reaktion består af 100 nM renset enzym, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM saccharopin. Reaktionsbufferen består af 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA og 0,05 % CHAPS. Forbindelsesbibliotekerne (LOPAC (Sigma) og NIH Clinical Collections I&II) blev screenet internt ved 20 μM forbindelseskoncentration.
Differential scanning fluorimetry
DSF blev udført i en 96-hulsplade ved hjælp af en Mx3005p RT-PCR-maskine (Stratagene) med excitations- og emissionsfiltre på henholdsvis 492 og 610 nm. Hver brønd bestod af 2 µL protein i 2 µM DSF-buffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE fortyndet 1000 gange i DSF-buffer fra producentens lager (Invitrogen) og (hvis det er relevant) 2 µL ligand i forskellige koncentrationer. Fluorescensintensiteterne blev målt fra 25 til 96 °C med en rampehastighed på 3 °C/min.
Krystallisering
Apo-krystaller blev fremstillet ved at blande 50 nL hAASS-SDH-protein (80 mg/mL) med 100 nL reservoiropløsning indeholdende 20 % PEG3350, 0,1 M Tris pH 7,5 og 0,2-0,33 M natriummalonat. NAD+-bundne krystaller blev fremstillet ved at blande 100 nL hAASS-SDH (18 mg/mL, i molært overskud af NAD+) med 50 nL reservoiropløsning indeholdende 25 % PEG3350, 0,2 M NaCl og 0,1 M tris pH 8,5. Krystallerne blev kryo-beskyttet i 9% butandiol før nedfrysning i flydende nitrogen. Til fragmentscreeningkampagnen blev krystallerne lagt i blød med forbindelser (10/50/500 mM) i krystalliseringsopløsningen suppleret med 8% butandiol i 5-30 min. og frosset ned i flydende nitrogen.
Strukturbestemmelsesprocedurer
hAASS-SDH apo- og NAD+-bundne krystaller hører til forskellige rumgrupper (P43212 vs. P212121). Strukturen af hAASS-SDH blev løst ved molekylær udskiftning med programmet PHASER ved hjælp af svampesaccharopinreduktase fra S.cerevisiae (PDB-kode 2AXQ) som søgemodel (38 % sekvensidentitet). Der blev fundet to molekyler i den asymmetriske enhed (a.u.). Den oprindelige model blev genopbygget ved hjælp af phenix.autobuild. Et bundet NAD+-molekyle i det aktive sted blev identificeret ved hjælp af difference Fourier-metoden og manuelt placeret i elektrontætheden ved hjælp af Coot. For at færdiggøre modellen blev der udført iterative cyklusser af phenix.refine, herunder TLS-raffinering, efterfulgt af manuel modelopbygning for manglende rester ved hjælp af coot. Der blev ikke anvendt NCS-begrænsninger på grund af konformationsforskelle i domæne III (res 278-376) i de to kopier i a.u. Opløsningsmiddelatomer blev placeret i løbet af de sidste fire raffineringsrunder ved hjælp af phenix.refine. Til fragmentscreeningskampagnen blev liganderne identificeret ved hjælp af DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) ved hjælp af differencetæthedskort. Svagere bindemidler med lav belægning blev evalueret ved hjælp af PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), der er baseret på statistiske modeller til at finde liganddensitet, der er til stede i et givet datasæt, som ikke er til stede i størstedelen af datasættene. Koordinater og strukturfaktorer for alle datasæt er deponeret i RCSB Protein Data Bank. Statistikker om dataindsamling og raffinering er tilgængelige på PDB-siderne.
Commercielt tilgængelige reagenser
CRISPR/Cas9 knockout plasmider
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157