Da nøjagtig proteinbestemmelse er afgørende for alle eksperimenter i forbindelse med proteinundersøgelser, er der blevet udviklet forskellige metoder til at måle koncentrationen af proteiner i et givet assay. Nogle af de mere traditionelle metoder til kvantificering af totalprotein omfatter måling af UV-absorbans ved 280 nm (A280), Bicinchoninsyre (BCA) og Bradford-assays samt andre alternative metoder såsom Lowry- og andre nye assays.
Da proteiner absorberer lys ved en bestemt bølgelængde, kan der foretages måling ved hjælp af et spektrofotometer. Specielt har aminosyrerne tyrosin og tryptofan en meget specifik absorption ved 280 nm, hvilket muliggør direkte A280-måling af proteinkoncentrationen.
UV-absorption ved 280 nm anvendes rutinemæssigt til at estimere proteinkoncentrationen i laboratorier på grund af dens enkelhed, brugervenlighed og prisvenlighed. Målingerne er hurtige og meget reproducerbare, da der ikke er behov for inkubation. Desuden kræver denne metode også en ekstremt lille prøvevolumen, da moderne spektrofotometre anvender et prøvetilbageholdelsessystem under målingen.
Det skal dog sikres, at proteinprøven ikke indeholder nogen ikke-proteinkomponenter (f.eks. nukleinsyrer) med det samme absorptionsspektrum, da det kan føre til fejlagtige resultater. Ud over at bestemme proteinkoncentrationer kan absorbansværdier også bruges til at påvise konformationsændringer og ligandbinding og til at følge enzymreaktioner.
Effekten af tryptofan og tyrosin ved proteinkvantificering
På grund af tilstedeværelsen af tyrosin og tryptofan absorberer proteiner og peptider, der indeholder disse aromatiske aminosyrer, UV-lys ved en bølgelængde på 280 nm. Hver af disse rester har forskellige absorptions- og emissionsbølgelængder og varierer i kvanteudbytte. Phenylalanin og disulfidbindinger bidrager også til absorptionen ved denne bølgelængde, men da den er relativt ubetydelig, kan den kun observeres i fravær af både tryptofan og tyrosin.
Mange enzymatiske cofaktorer, der indeholder aromatiske ringstrukturer (f.eks. FMN, FAD, NAD og porphyriner), absorberer også UV-lys til excitation og bidrager derfor til intensiteten af den resulterende fluorescens. Særlige proteiner som f.eks. grønt fluorescerende protein har også en intern serinetyrosin-glycin-sekvens, der modificeres posttranslationelt og er fluorescerende i det synlige lysområde.
Tryptofan
Tryptofan er betydeligt mere fluorescerende end tyrosin og phenylalanin. Dens fluorescerende egenskaber er imidlertid opløsningsmiddelafhængige, dvs. at spektret forskydes til kortere bølgelængder og øges i intensitet, efterhånden som opløsningsmidlets polaritet aftager. Som sådan udviser tryptofanrester begravet i hydrofobiske domæner af foldede proteiner en spektralforskydning på 10 til 20 nm.
På grund af dets større absorptivitet, højere kvanteudbytte og resonansenergioverførsel ligner fluorescensspektret af et protein, der indeholder de tre aminosyrer, normalt tryptofans spektrum.
Tyrosin
Tyrosin kan exciteres ved bølgelængder, der svarer til tryptofans, men vil emittere ved en markant anden bølgelængde. Selv om det kan være rigtigt, at tyrosin er mindre fluorescerende end tryptofan, kan det give et betydeligt signal, da det ofte er til stede i stort antal i mange proteiner. Tyrosinfluorescens er blevet observeret til at blive slukket af tilstedeværelsen af nærliggende tryptofanenheder enten gennem resonansenergioverførsel eller ionisering af dets aromatiske hydroxylgruppe.
Der er nogle vigtige punkter at huske, når man måler peptider ved hjælp af A280-metoden.
- Proteiner med samme molekylvægt kan have forskellige absorbansværdier på grund af forskellen i tryptofan- og tyrosinindholdet.
- UV-absorbans påvirkes også af proteinstrukturen. Således kan forhold, der påvirker strukturen (såsom temperatur, pH, ionstyrke eller tilstedeværelse af detergenter), påvirke de aromatiske restes evne til at absorbere lys ved 280 nm og ændre værdien af proteinets ekstinktionskoefficient.
- Det lokale miljø for de aromatiske aminosyrer kan have en effekt på deres spektrer. Det betyder, at tryptofan vil have et emissionstop ved lavere bølgelængder, når det er begravet i de hydrofobiske indre områder af et protein, mens tyrosin ofte vil overføre sin energi til de tilstødende tryptofanaminosyrer. Ioniseret tyrosinat, som dannes, når der tabes protoner fra tyrosin som følge af stigende pH-værdi, vil vise bølgelængder svarende til tryptofan.