Isolering og karakterisering af urenheder i 8-khlorotheophyllin

Korresponderende forfatter: S. Y. GABHE E-mail:

Abstract

En simpel isokratisk reversed phase højtydende væskekromatografi med omvendt fase blev anvendt til at adskille tre urenheder, der var til stede i prøven af 8-chlorotheophyllin. LC-MS blev anvendt til karakterisering af urenhederne. På grundlag af massespektraldata blev strukturerne af disse urenheder karakteriseret som 3,7-dihydro-1,3-dimethyl-1H-purin-2,6-dion (urenhed I), 3,7-dihydro-1,3,7,7-trimethyl-1H-purin-2,6-dion (urenhed II) og isomer af 8-chlor-1,3-dimethyl-2,6(3H,1H)-purinedion (urenhed III).

Nøgleord

8-Chlorotheophyllin, urenhed, LC-MS, reversed phase HPLC, theophyllin

Introduktion

Bulk-lægemiddelindustrien udgør grundlaget for alle farmaceutiske industrier, da den er kilden til aktive farmaceutiske ingredienser (API’er) af specificeret kvalitet. Den største udfordring for bulkmedicinindustrien er at producere det endelige lægemiddel af den krævede kvalitet og renhed på en økonomisk måde. Renheden af API’er afhænger af flere faktorer som f.eks. råmaterialer, deres fremstillingsmetoder og typen af krystalliserings- eller rensningsproces. Det er imidlertid næsten umuligt at opnå helt rene materialer, da urenheder indgår i dem enten under fremstilling, rensning eller opbevaring. En urenhed er enhver komponent i et lægemiddelstof (bortset fra vand), som ikke er en kemisk enhed, der er defineret som lægemiddelstof. For lægemiddelstoffer fremstillet ved kemisk syntese klassificerer ICH urenheder i tre kategorier, nemlig organiske urenheder, uorganiske urenheder og restopløsningsmidler. De urenheder, der er til stede i stoffet, kan være giftige og kan ændre stoffets fysiske eller kemiske egenskaber og dermed gøre det medicinalt ubrugeligt. Urenheder kan nedsætte produktets holdbarhed og kan forårsage vanskeligheder i forbindelse med formuleringen. Derfor er ikke kun kontrol af urenheder, men også kvalificering af urenheder et kritisk spørgsmål for bulkmedicinindustrien.

Antihistaminer som f.eks. dimenhydrinat og promethazintheoclat er meget anvendte lægemidler til behandling af køresyge. 8-Chlorotheophyllin, kemisk set 8-chlor-1,3-dimethyl-2,6(1H, 3H)-purinedion, er et mellemprodukt, der anvendes ved fremstillingen af saltformen af disse lægemidler. Det er vigtigt at sikre renheden og sikkerheden af dimenhydrinat og promethazintheoclat. For at opnå dette skal 8-chlorotheophyllin fremstilles med den højeste renhed og med en kendt urenhedsprofil.

Fra litteraturgennemgangen fremgår det, at Wadke et al. har undersøgt interaktionerne mellem 9-methylisoalloxazine og 3,9-dimethylisoalloxazine og 8-chlorotheophyllin. 8-chlorotheophyllin blev anvendt som intern standard til bestemmelse af urat ved hjælp af HPLC-metoden. Det blev også bestemt potentiometrisk. Den samtidige bestemmelse af chlorfenoxaminhydrochlorid, 8-chlorotheophyllin og koffein i flerkomponentdosisformen blev foretaget ved hjælp af en tyndtlagskromatografisk-densitometrisk metode. Gil et al. undersøgte den elektroanalytiske adfærd af 8-chlorotheophyllin ved cyklisk voltammetri og differentiel impulspolarografi og bestemte indholdet heraf i farmaceutiske præparater ved differentiel impulspolarografi. Der blev udviklet og valideret en stabilitetsindikerende RP-HPLC-metode for 8-chlorotheophyllin sammen med diphenhydramin og koffein. Der blev også udviklet spektrofotometriske og kemometriske metoder til samtidig bestemmelse af koffein, 8-chlorotheophyllin og chlorphenoxaminhydrochlorid i ternære blandinger. Indtil videre er der ikke blevet rapporteret om nogen kromatografisk og spektroskopisk metode til adskillelse og karakterisering af urenheder i 8-chlorotheophyllin. Derfor blev dette arbejde iværksat med henblik på at isolere og karakterisere urenheder i 8-chlorotheophyllin ved hjælp af moderne analyseteknikker.

8-Chlorotheophyllin var en gaveprøve fra Kores (India) Ltd., Thane. Alle andre kemikalier og reagenser blev fremskaffet fra S. D. Fine Chemicals Ltd (Mumbai, Indien). De opløsningsmidler, der blev anvendt til TLC- og præparative TLC-undersøgelser, var af analytisk kvalitet, og de opløsningsmidler, der blev anvendt til HPLC-undersøgelser, var af HPLC-kvalitet. Natriumacetat trihydrat af AR-kvalitet blev anvendt til fremstilling af buffer.

I første omgang blev der udført TLC-undersøgelser for at kende antallet af urenheder i prøven. Der blev anvendt præcoatede TLC-plader af silicagel 60GF254 (Merck) som stationær fase. Prøven blev opløst i en minimumsmængde ethylacetat, og denne opløsning blev brugt til at plette TLC-pladerne. Der blev afprøvet forskellige mobile faser. Ethylacetat:toluen:iseddikesyre (10:0,3:0,5 v/v/v/v) viste en bedre adskillelse sammenlignet med andre mobile faser. Fire komponenter blev adskilt fra prøven af 8-chlorotheophyllin ved hjælp af TLC med Rf-værdier på henholdsvis 0,029, 0,132, 0,198 og 0,852. 8-chlorotheophyllin havde en Rf-værdi på 0,852.

Når den mobile fase til TLC var udviklet, blev der gjort et forsøg på at adskille blandingen ved hjælp af præparativ TLC. Prøven blev opløst i en minimal mængde ethylacetat og plettet i form af et bånd. Alle tre urenheder blev adskilt fra 8-chlorotheophyllin ved præparativ TLC under anvendelse af de samme kromatografiske betingelser som dem, der blev anvendt i TLC-undersøgelserne. De forskellige bånd blev opsamlet separat og ekstraheret med ethylacetat. Da mængderne af hver enkelt isoleret urenhed I, II og III var meget små, blev det besluttet at isolere disse urenheder samlet. Urenhed I, II og III blev tilsammen betegnet som fraktion I. Fraktion I blev isoleret fra 8-chlorotheophyllin ved præparativ TLC. Da hver urenhed ikke blev isoleret separat, kunne der ikke anvendes forskellige identifikationsteknikker som f.eks. IR og NMR. Det blev besluttet at foretage yderligere undersøgelser ved hjælp af LC-MS, som muliggør samtidig adskillelse og karakterisering. Forud for LC-MS-analysen blev der udviklet en HPLC-profil for fraktion I. Til HPLC-undersøgelserne blev der anvendt en Tosoh højtydende væskekromatograf udstyret med en CCPM-pumpe med frem- og tilbagegående pumpe, en pumpestyring PX8010 og en UV-detektor. Der blev monteret en sløjfe med en kapacitet på 20 µl på injektionsventilenheden. Fraktion I blev opløst i acetonitril og blev underkastet HPLC-analyse i omvendt fase med mobil fase bestående af acetonitril: natriumacetat trihydrat (pH 3,57; 0,01 M) (5:95 v/v). Den valgte søjle var Phenomenex ODS (250×4,6 mm I.D.; partikelstørrelse 5 µm). Strømningshastigheden var 1,5 ml/min, og detektionen blev overvåget ved en bølgelængde på 280 nm. Den mobile fase blev filtreret gennem et G5-sintret glasfilter under vakuum før brug og soniceret for at fjerne luftbobler. HPLC-analysen af fraktion I afslørede også tre toppe med en gennemsnitlig retentionstid på henholdsvis 8,324 min, 14,275 min og 20,933 min (fig. 1). Toppen med en gennemsnitlig retentionstid på 2,086 min var opløsningsmiddeltoppen.

Fraktion I blev derefter underkastet LC-MS-analyse med henblik på karakterisering af urenheder. LC-MS undersøgelser blev udført på et system, hvor LC delen bestod af 1100 serie HPLC (Agilent Technologies, USA) bestående af en vakuumafgasser (G1322A), quaternær pumpe (G1311A), en automatisk sampler (G1313A) og en UV/synlig detektor (G1314A) og MS delen bestod af triple quadrupol massespektrometer Quattro II (Micromass UK Ltd.,

I LC-MS-undersøgelser blev væskekromatografiske separationer opnået ved hjælp af Phenomenex C18-kolonne (250×4,6 mm, 5 µm) ved stuetemperatur med den mobile fase af acetonitril: natriumacetatbuffer (5:95, v/v) ved en strømningshastighed på 1,5 ml/min. Massespektrometeret blev kørt i positiv elektronsprayioniseringstilstand (ESI) med masse/ladningsforhold (m/z) i intervallet 120-500 m/z. Der blev anvendt kvælstof som forstøvningsgas. Dataene blev indsamlet og behandlet med Masslynx-softwaren. Der blev opnået massespektraldata for urenhederne (fig. 2, 3 og 4). Fragmenteringsvejen for tre toppe er karakteriseret ved tab af methylgruppe og/eller carbonylgruppe. Toppene med m/z-værdierne 180,9, 195,7 og 214,9 svarer til henholdsvis +-, +- og +-toppe. Ifølge de opnåede MS-data var den urenhed, der eluerede ved 8,324 min, 14,275 min og 20,933 min, henholdsvis theophyllin (molvægt 180), koffein (molvægt 194) og en isomer af 8-chlorotheophyllin (molvægt 214,5) (tabel 1). Der blev således adskilt tre urenheder, og deres strukturer blev opklaret på grundlag af massespektraldata (skema 1).

TABEL 1: HPLC-MS IDENTIFIKATION AF FRAKTION I

Anerkendelse

Authorerne er taknemmelige over for Kores (India) Ltd., Thane for at stille gaveprøve af 8-chlorotheophyllin til rådighed.

1. Kasture AV, Wadodkar SG, Mahadik KR, More HV. Farmaceutisk analyse. Vol. 1. Pune: NiraliPrakashan; 1997. s. 12-4.
2. United State Pharmacopoeia, Vol. 26. Rockville, MD: United States Pharmacopoeia Convention, Inc.; 1999. s. 2049-59.
3. Ahuja S, Alsante KM. Handbook of isolation and characterization of impurities in pharmaceuticals (håndbog om isolering og karakterisering af urenheder i lægemidler). California: Academic Press; 2003. s. 6.
4. Foye WO, Lemke TL, Williams DA. Principles of Medicinal Chemistry. 4th ed. New Delhi: B. I. Waverly Pvt Ltd; 1995. s. 419.
5. Reynolds JE. Martindale-The Extra Pharmacopoeia. 29th ed. London: Pharmaceutical Press; 1989. s. 451,459.
6. Wadke DA, Guttman DE. Kompleksdannelsens indflydelse på reaktionshastigheden III. Interaktion mellem nogle isoalloxaziner og 8-chlorotheophyllin som bestemt ved spektrale, opløseligheds- og kinetiske metoder. J Pharm Sci 1965;54:1293.
7. Bennett MJ, Patchett BP, Worthy E. A simple HPLC method for the determination of urate in serum and urine using 8-chlorotheophylline as internal standard. Med Lab Sci 1984;41:108-11.
8. Nikolic K, Medenica M. Potentiometrisk bestemmelse af 8-chlorotheophyllin. Microchimica Acta 1986;88:5.
9. Bebawy LI, El-Kousy NM. Simultanbestemmelse af nogle multikomponentdoseringsformer ved kvantitativ tyndtlagskromatografidensitometrisk metode. J Pharm Biomed Anal 1999;20:663-70.
10. Gil EP, Blazquez LC, Garcia-MoncoCarra RM, Misiego AS. Polarografisk opførsel af 8-chlorotheophyllin og bestemmelse heraf i doseringsformer. Electroanalysis 1993;5:343.
11. Barbas C, Garcia A, Saavedra L, Castro M. Optimering og validering af en metode til bestemmelse af koffein, 8-chlorotheophyllin og diphenhydramin ved isokratisk højtydende væskekromatografi Stresstest til stabilitetsvurdering. J ChromatogrA 2000;870:97-103.
12. Kelani KM. Simultan bestemmelse af koffein, 8- chlorotheophyllin og chlorphenoxaminhydrochlorid i ternære blandinger ved hjælp af spektrofotometriske og kemometriske metoder til bestemmelse af forholdsspektrer med nul-krydsning af første afledte spektrofotometriske og kemometriske metoder. J AOAC Int 2005;88:1126-34.