Abstract
Baggrund. ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1)-proteinet er en peroxisomal halvtransportør, der muliggør nedbrydning af meget langkædede fedtsyrer (VLCFA). Patogene varianter af ABCD1 medfører, at VLCFA’er ophobes i forskellige væv og kropsvæsker, hvilket resulterer i en lidelse kaldet X-bundet adrenoleukodystrofi (X-ALD). Denne lidelse er oftest kendetegnet ved adrenokortikal insufficiens og høj VLCFA-koncentration og har varierende niveauer af neurologisk involvering afhængigt af fænotype. F.eks. har den Addison-only form af X-ALD ingen neurologisk påvirkning, mens den cerebrale form af X-ALD ofte forårsager alvorligt sansetab, nedsat motorisk funktion, kognitiv svækkelse og død. Metoder. En nyligt karakteriseret og formodet patogen variant i ABCD1 blev analyseret ved hjælp af vores proteininformatikplatform (PIP). Personaliserede molekylære undersøgelser på proteinniveau blev gennemført på genetiske testdata, hvilket supplerede analysen og den kliniske undersøgelse. Resultater. Et tilfælde af adrenomyeloneuropati (AMN) hos voksne og en ny ABCD1-variant er præsenteret. Det unikke ABCD1-protein diskuteres, og forsøgspersonens tilfælde sammenlignes med eksisterende rapporter om AMN. Konklusioner. Datafusion fra flere kilder blev kombineret i en omfattende tilgang, der gav en beriget vurdering af patientens sygdom og prognose. Molekylær modellering blev udført på varianten for bedre at karakterisere dens kliniske betydning og bekræfte patogenicitet.
1. Indledning
Proteinet ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1) er en del af ATP-binding cassette transporter superfamilien, som består af transmembranproteiner, der er ansvarlige for at overføre lipider, metabolitter og andre molekyler mellem celler eller intracellulære strukturer. Det er kodet af ABCD1, et gen, der er placeret på Xq28 . ABCD1 er en peroxisomal halvtransportør, der importerer meget langkædede fedtsyrer (VLCFA) til peroxisomet ved at binde ATP. Dysfunktionelt ABCD1 er ude af stand til at flytte VLCFA’er til peroxisomet for at blive nedbrudt, hvilket resulterer i ophobning af VLCFA’er i kropsvæsker og væv . Dette unormale niveau af VLCFA’er tjener som en karakteristisk biomarkør for X-bunden adrenoleukodystrofi (X-ALD), den mest almindelige peroxisomale lidelse . X-ALD er en genetisk tilstand, der primært er forbundet med demyelinisering, neurodegeneration og adrenokortikal insufficiens . Der er blevet rapporteret over 800 varianter inden for ABCD1-genet . På trods af dette er der ikke observeret klare genotype-fænotype korrelationer .
Hemizygote mænd udviser typisk de mest signifikante symptomer, mens heterozygote kvinder ofte udvikler en mindre grad af handicap senere i livet . De tre klassiske fænotyper er Addisons sygdom-only, adrenomyeloneuropati (AMN) og cerebral ALD. Personer med den rene Addison-sygdom-form viser sig normalt med binyrebarkinsufficiens mellem 2 og 7 år. Neurologisk degeneration er ikke til stede i begyndelsen, men den udvikler sig ofte i takt med, at individet bliver ældre. AMN indtræder typisk i tredje til fjerde årti af livet og påvirker primært rygmarven . Det første kliniske træk er ofte progressiv stivhed og svaghed i benene. Binyrebarkinsufficiens findes hos ca. 2/3 af AMN-patienterne, og cerebrale forandringer rammer omkring halvdelen af dem . Cerebral ALD er den mest alvorlige fænotype, hvor cerebral demyelinisering forårsager hurtig tilbagegang i hørelse, syn, motorik og kognition . Denne variant af X-ALD, der oftest findes hos børn eller unge, resulterer ofte i døden inden for 2-4 år efter symptompræsentation .
Denne rapport beskriver historien om en proband, der blev diagnosticeret i trediverne med AMN. Molekylær analyse af ABCD1-genet identificerede en variant af usikker betydning hos denne person. Interessant nok er denne variant blevet rapporteret patogen i ALD Mutation Database, men oplysninger vedrørende det kliniske tilfælde blev ikke offentliggjort. Vores probands kliniske tilfælde er inkluderet for bedre at understøtte patogeniciteten af denne ABCD1-variant. Protein informatics platform (PIP) blev anvendt til omfattende molekylær modellering for yderligere at karakterisere betydningen af denne variant og afklare til probandens diagnose.
2. Case Study (Clinical Description)
Proband var en 31-årig mand, der præsenterede sig for evaluering af en progressiv neurologisk tilstand. Symptomerne på denne tilstand viste sig første gang for 2 år siden, da proband begyndte at snuble stadig oftere. Han ville senere opleve generaliseret muskelsvaghed og stivhed sammen med yderligere gangdysfunktion. For at bekæmpe dette havde forsøgspersonen de sidste 7 måneder brugt en rollator til at hjælpe ham med at bevæge sig rundt. Han havde også udviklet urininkontinens. Desuden rapporterede han om hjernetåge, hukommelsestab, opmærksomhedsforstyrrelser, angst og træthed. Grundlæggende mentale opgaver tog længere tid at udføre som følge heraf. Ifølge forsøgspersonen forværrede alkoholforbruget disse mangler. Endelig tabte forsøgspersonen 20 pund siden starten af sin tilstand og var ikke i stand til at genoptage vægten på trods af en samordnet indsats for at gøre det. Dette vægttab skyldtes delvist symptomer på kvalme og opkastninger, som var mest almindelige om morgenen.
Under den fysiske undersøgelse var forsøgspersonen ikke i stand til at rejse sig fra en siddende stilling uden brug af sine hænder. Der blev konstateret mild ataktisk dysartri. Visuelle fikseringstest afslørede sjældne firkantede ryk. Glatte forfølgelser var saccadiske, og han udviste langsomme, fulde saccader både vertikalt og horisontalt. Strækningsreflekserne var patologisk hurtige i de øvre ekstremiteter. Forsøgspersonen havde også patologisk raske mitotiske strækreflekser i de nedre ekstremiteter, herunder vedvarende klonus ved anklerne. Der var moderat nedsat proprioception af de store tæer. Der blev set en mild svaghed i de øvre motoriske neuronfordelinger i de nedre ekstremiteter med skånelse af iliopsoas. Testning fra hæl til skinne viste dyssynergi. Under gangen kiggede forsøgspersonen på sine fødder og bevægede sig med reduceret skridtlængde. Hans knæ var hyperextenderede, han havde tendens til at gå på tå, og lejlighedsvis gled han med fødderne. Romberg-tegnet var til stede. Når han stod op, var der rystende bevægelser i hans ben – overvejende i quadricepsmusklerne. Forsøgspersonen drejede 360 grader i løbet af 3 forsøg, hvilket krævede 9 til 15 skridt pr. drejning. Hans posturale reflekser var unormale, og “Pull”-prøven var -3.
MRI af hjernen var normal, og MRI af halshvirvelsøjlen afslørede fund, der tydede på mild, diffus rygmarvsatrofi. Der var ingen tegn på subakut kombineret degeneration eller anden erhvervet rygmarvssygdom (figur 1). Han var blevet behandlet for borreliose, da hans borreliose-IgM-titer var positive, men der var ikke registreret nogen væsentlig forbedring. Hans cerebrospinalvæske blev beskrevet som acellulær. Evaluering af HIV, HTLV1, hepatitis C, hepatitis B og cytomegalovirus var negativ. Familiehistorie med lignende symptomer kunne ikke fastslås, da probandens kendskab til deres sygehistorie var begrænset (figur 2).
Forbindelsespersonens peroxisomale fedtsyreprofil blev indhentet efter de tidligere undersøgelser og billeddannelse. Der var unormale koncentrationer af C26 : 0, C24/C22 og C26/C22 til stede, hvilket tydede på hemizygositet for X-bunden adrenomyeloneuropati. Adrenocorticotropisk hormon målte 528 pg/mL (RR: 7,2-63). Derefter blev der foretaget sekventering og deletions-/duplikeringsanalyse af ABCD1-genet. Forældrene var hemizygote for en variant af usikker betydning i ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Denne variant var ikke til stede i ExAC-onlinedatabasen, selv om den var opført som patogen i ALD Mutation Database. To lignende varianter, c.1596A>G (p.Lys533Glu) og c.1598A>G (p.Lys533Arg), er også tidligere blevet rapporteret som klinisk signifikante .
3. Metoder
3.1. Strukturel modellering
Sekvensen af humant ATP-binding cassette subfamily D member 1 (kendt som ABCD1) er sandsynligvis et transportprotein, som har en nukleotidbindende region med en fold, der kan fungere som en ATP-bindende underenhed med ATPaseaktivitet. Det er kendt, at korrekt dimerisering er nødvendig for at danne en aktiv transporter. ABCD1 er et medlem af ALD-subfamilien, der deltager i peroxisomal fedtsyreimport til organeller. Disse peroxisomale ABC-transportører er “halvtransportører”, hvilket betyder, at de kræver et halvt transportmolekyle som partner – den funktionelle form er altid homodimerisk eller heterodimerisk. ABCD1 antages at være nøglen til peroxisomal transport eller katabolisme af meget langkædede fedtsyrer. ABCD1 er kendt for at interagere med PEX19 og er kodet af ABCD1-genet, som blev taget fra NCBI Reference Accession Sequence: NP_000024: version NP_000024.2, som er kodet for aminosyresekvensen; og blev anvendt til computerassisteret modellering. Monte Carlo-simuleringer blev udført på mutanten for at muliggøre lokale regionale ændringer for 745 aminosyrer i fuld længde.
Røntgenforfiningen til Monte Carlo blev opbygget ved hjælp af YASARA SSP/PSSM-metoden . Strukturen blev afslappet til YASARA/Amber kraftfeltet ved hjælp af vidensbaserede potentialer i YASARA. Sidekæderne og rotamere blev justeret med vidensbaserede potentialer, simuleret udglødning med eksplicit opløsningsmiddel og små equilibreringssimuleringer ved hjælp af YASARA’s raffineringsprotokol . Hele strukturen i fuld længde blev modelleret, idet eventuelle huller eller uopløste dele fra røntgenbilledet blev udfyldt.
Forfining af de færdiggjorte modeller blev afsluttet ved hjælp af enten Schrodinger’s LC-MOD Monte Carlo-baserede modul eller NAMD2-protokollerne. Disse raffineringer startede med YASARA-genereret indledende raffinering og variant . Overlejringen og den efterfølgende forfining af de overlappende områder giver en komplet model for ABCD1. De endelige strukturer blev underkastet energioptimering med PR konjugeret gradient med et R-afhængigt dielektrikum.
Atomkonsistens blev kontrolleret for alle 745 aminosyrer (12.201 atomer) i den fulde wildtypemodel (WT) og 745 aminosyrer (12.221 atomer) for varianten, idet korrekthed af kædenavn, dihedraler, vinkler, torsioner, ikke-bindinger, elektrostatik, atomtypebestemmelser og parametre blev verificeret. Der forudsiges en dimer-model, som består af 24 402 atomer, herunder cofaktorer og ioner. Hver model blev eksporteret til følgende formater: Maestro (MAE) og YASARA (PDB). Modelmanipulation blev foretaget med Maestro (Macromodel, version 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010) eller Visual Molecular Dynamics (VMD) . Analyser blev fremhævet på N-terminus-regionen, der indeholder de første 350 aminosyrer i betragtning af længden og C-term afstanden fra stedet for mutation.
Monte Carlo dynamik søgning (hybrid MC eller via forbedre MDS sampling) blev afsluttet på hver model til konformationsprøvetagning, ved hjælp af metoder, der tidligere er beskrevet i litteraturen . Kort fortalt blev hvert ABCD1-variantsystem minimeret med afslappede begrænsninger ved hjælp af enten Steepest Descent eller Conjugate Gradient PR, hvorefter det fik lov til at gennemgå MC-søgningskriterierne, som vist i litteraturen . Det primære formål med MC, i dette scenario, er at undersøge enhver konformationsvariabilitet, der kan forekomme med forskellige mutationer i regionen nær mutationen og den mulige effekt på DNA-binding eller behandling med ABCD1.
4. Resultater
4.1. Struktur-funktionsundersøgelser
For WT versus varianten p.K533E fandt vi, at objektets stabilitet ud fra energetiske beregninger for ΔG pr. aminosyre forbliver relativt ens, således at WT har en objektstabilitet på 114,67 kcal/mol∗Å2. Varianten p.K533E medfører en nettoforøgelse af den frie energi på 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, hvilket kan være destabiliserende for den lokale region . Denne objektstabilitet var positiv, hvilket indikerer, at nogle dynamiske ændringer er sandsynlige med en molekylær simulering til konformationsprøvetagning. Således undersøgte vi de lokale rester og bestemte, at en elektrostatisk beregning kan være nyttig til at forklare ændringen i funktionen. Den molekylære model for den fulde struktur og dens variantform er givet (figur 3(a)) ved hjælp af vores state of the art-metoder, som er blevet etableret . Den dimeriske model er kritisk for funktionen og viser vigtige interaktioner på mutationsstedet, som forstyrres af variantmutationen.
Lokale rester inden for 12 Å afgrænsning i nærheden af variantstedet (p.K533E) omfatter rester fra begge monomerer. Den monomer, der indeholder varianten (monomer 1, grå karboner), har følgende nærliggende rester med position 533-interaktioner: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 og K624 (figur 3(b)). Denne variantstruktur (p.Lys533Glu) blev analyseret, og der blev indikeret en mere direkte forstyrrelse af det lokale miljø fra den positive lysinladning (+), der flippede til en negativ glutaminsyre (-), som var ret forstyrrende for de tilstødende ladede rester (ovenfor). Især er resterne K624, E499 og Y532 placeret i forskellige interaktioner (figur 3(b)). Lokal ΔG pr. aminosyre øger en positiv nettoværdi svarende til ugunstig stabilitet i lommen, og længere dynamik ville være nødvendig for at bestemme den samlede effekt, men kan forventes at være destabiliserende. K533E-residuen har interessante interaktioner med Q472, I474, I475 og E499. K533E befinder sig i en helix-helix-region, hvor dens ladede sidekæde er placeret udad mod modsat ladede arter; der er også en vis helix-helix-interaktion med de tilstødende helixer (figur 3(b) og 3(c)). De samme rester er impliceret i varianten, men positionen er ændret for flere af resterne, herunder P534, P535 og K624 (figur 3(c)). Denne interaktion kan være årsag til ændret funktion på grund af ændring i den dynamiske adfærd for den lokale strukturelle stabilitet (figur 3(c)). Elektrostatiske beregninger blev gennemført med henblik på yderligere analyse (figur 4). Især er resterne K624, E499 og Y532 placeret i forskellige interaktioner (figur 3(b)). Lokal ΔG pr. aminosyre øger en positiv nettoværdi svarende til ugunstig stabilitet i lommen, og længere dynamik ville være nødvendig for at bestemme den samlede effekt, men kan forventes at være destabiliserende.
4.2. Dimerdannelsesvirkninger
Mapping af elektrostatik blev udført ved hjælp af Poisson-Boltzmann-beregningen for opløsning på hele 745 aminosyrestrukturen. Virkningerne af ændringerne var stærkt udtalt på den elektrostatiske fordeling med en +3 KT/E cutoff for begge. WT-partiklen (alle 745 aa) viser en tydelig fordeling af ladning omkring K533, som viser få negativt ladede områder og store neutrale lommer på grund af de rige hydrofobiske rester, der findes i de ovennævnte helikser. Threonin-mutationen synes at ændre fordelingen af ladningerne og placerer positionen for de negative ladninger længere væk fra hinanden, samtidig med at størrelsen af de neutralt ladede regioner øges (figur 4(a) og 4(b)). Den lokale p.K533E-region er ladet for at matche den positive lysinrest med de tilstødende glutaminsyrerester (inden for 6 Å) (Figur 4(b)) (Figur 4(b)). Omvendt har rest K533 positive ladninger, der påvirkes af rester inden for 6 Å, nemlig E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 og K624 (Figur 4(a)) . Varianten p.K533E ser ikke ud til at have nogen effekt på selve dimeren (figur 3 og 4), da varianten ligger distalt fra grænsefladen mellem monomerne. Der er imidlertid en betydelig forstyrrelse i den lokale nærhed, hvor lysinen er nativt indsat i en lomme med sine nærliggende rester, der er modsat ladede og indgår i H-bindinger og saltbrointeraktioner, som går tabt med den negative ladning fra glutaminsyresubstitutionen (figur 3).
5. Diskussion
For patienter med AMN er mulighederne for behandling i øjeblikket begrænsede. Nyere forskning med musemodeller udgør imidlertid en potentiel løsning. Hos X-ALD-patienter ledsages ophobningen af VLCFA’er af øgede niveauer af radikale oxygenarter. Disse radikaler fremmer sygdomsprogressionen, beskadiger vævet og forårsager i sidste ende fremkomsten af neurologiske symptomer. Mus med X-ALD-analoger er med succes blevet behandlet med en blanding af antioxidanter, hvilket har bragt radikalniveauerne under kontrol og standset denne patogene proces . Hvis senere forsøg fortsat viser sig at være lovende, er det muligt, at vores proband og andre AMN-patienter en dag kan blive behandlet på en lignende måde.
Selv om vores proband præsenterede en dårligt forstået variant i ABCD1, adskilte hans tilfælde sig ikke væsentligt fra den typiske AMN-fænotype. Symptomerne begyndte i slutningen af tyverne, hvilket passer fint ind i det forventede aldersinterval på 20 til 40 år. AMN har typisk rygmarvsinvolvering, hvilket blev bekræftet af probandens MRI’er. Hans svaghed i benene og gangforstyrrelser er karakteristiske for sygdommen, og det samme gælder urininkontinens. Opkast og kvalme er forbundet med binyrebarkinsufficiens, mens probandens tale og mentale abnormiteter kunne være forbundet med cerebrale forandringer . På trods af dette skal det siges, at en patient med den samme ABCD1-variant, som vores proband har udtrykt, kan have forskellige symptomer. Patogene varianter i ABCD1 resulterer sjældent i forudsigelige fænotyper – selv når en identisk version besiddes af familiemedlemmer .
Proteinininformatikken afledt af de statistiske mekanikberegninger anvendt på den molekylære modellering for varianterne versus vildtypen giver os klare indikationer for dysfunktion af den normale proteinadfærd på et molekylært niveau, der ville påvirke funktionen. For eksempel fandt vi, at variant p.K533E forårsager en nettoforøgelse af den frie energi på 2,321 kcal/aamolÅ2, hvilket destabiliserer det lokale område inden for 12 Å fra rest K533. På grund af den lokale strukturelle ændring afbødes gennem rygsøjlerester og sekundære strukturinteraktionsændringer (H-båndsnetværk ikke vist) tillader korreleret bevægelse at forplante sig i hele strukturen, hvilket yderligere frustrerer den korrekte dannelse af dimeren.
På grund af sjældenheden af vores probands ABCD1-variant var det kommercielle laboratorium ikke i stand til med sikkerhed at navngive varianten som patogen. Derudover gjorde logistiske udfordringer og probandens lille familiestørrelse det upraktisk at foretage familiesegregationsanalyse. Som følge heraf kunne denne proces ikke gennemføres for at hjælpe os med at få en bedre forståelse af betydningen af hans variant. Heldigvis gav den molekylære modellering os en ny mulighed. Molekylær proteinmodellering understøttede mistanken om, at denne variant ville påvirke proteinfunktionen på en klinisk betydningsfuld måde. Det var uden mistanke, at denne variant ikke ville være blevet klassificeret som patogen i betragtning af den grove ændring af strukturen, hvilket blev stærkt understøttet af PIP-analysen.
6. Konklusion
Sammenfattende rapporterer vi om en proband med en sjælden variant i ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Manglen på oplysninger om denne variant forhindrede det genetiske testfirma i at klassificere hans variant som patogen, men de molekylære ladninger synes at indikere, at denne region af proteinet er væsentligt forstyrret fra ligevægt (Figur 3(b)). Udnyttelse af proteinmodelleringen gav også oplysninger til indarbejdelse i probandens større kliniske billede. Desuden er et tilfælde af denne variants patogenicitet opført i ALD-mutationsdatabasen. Tilsammen gjorde disse beviser det muligt at stille en sikker diagnose af AMN. Vores forsøgsperson havde typiske symptomer på AMN, men den fænotypiske variabilitet, der er indbygget i ABCD1, kunne resultere i en anden X-ALD-præsentation for andre personer, der besidder denne variant.
Afkortninger
| ABCD1: | ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (gen) | |
| VLCFA: | Very long chain fatty acids | |
| X-ALD: | X-linked adrenoleukodystrophy | |
| AMN: | Adrenomyeloneuropathy. |
Databesiddelse
Datasæt og materialer er beskrevet i manuskriptet.
Samtykke
Alle fulgte procedurer var i overensstemmelse med de etiske standarder for den ansvarlige komité for eksperimenter på mennesker (institutionel og national) og med Helsinki-erklæringen fra 1975, som revideret i 2000 (5). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle patienter til at blive inkluderet i undersøgelsen.
Interessekonflikter
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Autors bidrag
Alle ovenstående forfattere har ydet væsentlige bidrag til udformning eller design af arbejdet; eller til erhvervelse, analyse eller fortolkning af data til arbejdet OG udarbejdelse af arbejdet eller kritisk revision af det med henblik på vigtigt intellektuelt samtykke OG gav endelig godkendelse af den version, der skal offentliggøres OG indvilligede i at stå til ansvar for alle aspekter af arbejdet ved at sikre, at spørgsmål vedrørende nøjagtigheden eller integriteten af enhver del af arbejdet undersøges og løses på passende vis.
Funding
Funding blev ydet af Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic, som gav midler til at gennemføre denne undersøgelse.
Akkreditering
TC takker Center for Individualized Medicine på Mayo Clinic Jacksonville for forskningsstøtte.