- Abstrakt
- 1. Introduktion
- 2. Materialer og metoder
- 2.1. Emner
- 2.2. Blodprøvetagning
- 2.3. Ekstraktion af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er)
- 2.4. RNA-ekstraktion og cDNA-syntese
- 2.5. Primerdesign
- 2.6. Evaluering af de biokemiske serumfaktorer
- 2.7. Analyse og fortolkning af resultater
- 3. Resultat
- 3.1. Resultater af qRT-PCR
- 3.2. Evaluering af genekspression i PBMC
- 4. Diskussion
- Interessekonflikter
- Akkreditering
Abstrakt
ABCA1- og ABCG1-gener koder for kolesteroltransporterende proteiner, der spiller en central rolle i kolesterol- og fosfolipidhomeostase. Denne undersøgelse havde til formål at evaluere og sammenligne ABCA1- og ABCG1-genernes ekspression hos patienter med metabolisk syndrom og raske personer. Denne case-kontrolundersøgelse blev udført på 36 patienter med metabolisk syndrom og det samme antal raske personer i Hamadan (vest for Iran) i løbet af 2013-2014. Samlet RNA blev ekstraheret fra mononukleære celler og renset ved hjælp af RNeasy Mini Kit-kolonne. Ekspressionen af ABCA1- og ABCG1-generne blev udført ved qRT-PCR. Lipidprofil og fastende blodglukose blev målt ved hjælp af kolorimetriske procedurer. ABCG1-ekspressionen hos patienter med metabolisk syndrom var signifikant lavere (ca. 75 %) sammenlignet med kontrolgruppen, mens der for ABCA1-ekspressionen ikke var nogen signifikant forskel mellem de to undersøgte grupper. Sammenligning af andre parametre såsom HDL-C, FBS, BMI, taljeomkreds og systolisk og diastolisk blodtryk mellem patienter med metabolisk syndrom og raske personer viste signifikante forskelle (). Faldet i ABCG1-ekspressionen hos patienter med metabolisk syndrom sammenlignet med raske personer tyder på, at hyperglykæmi, relaterede metabolitter og hyperlipidæmi over transportørkapaciteten resulterede i nedsat ekspression af ABCG1. Fravær af en signifikant ændring i ABCA1-genekspression mellem to grupper kan indikere en anden reguleringsmekanisme for ABCA1-ekspression.
1. Introduktion
Det metaboliske syndrom (MetS) er defineret som et sæt indbyrdes forbundne risikofaktorer for diabetes og kardiovaskulære sygdomme (CVD) . Der er nogle kriterier for klinisk diagnose af metabolisk syndrom, som omfatter forhøjet taljeomkreds (≥102 cm hos mænd og ≥88 cm hos kvinder), forhøjede triglycerider (≥150 mg/dL eller 1.7 mmol/L), nedsat high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C <40 mg/dL eller 1,03 mmol/L hos mænd og <50 mg/dL eller 1,3 mmol/L hos kvinder), og forhøjet blodtryk (≥130 mm Hg systolisk blodtryk eller ≥85 mmHg diastolisk blodtryk) . MetS kan diagnosticeres ved observation af tre af disse kriterier. I de sidste mange år er prævalensen af MetS steget på verdensplan ; i USA er den dog faldet fra 25,5 % i 1999/2000 til 22,9 % i 2009/2010 . Weiss og kolleger rapporterede, at fedme er direkte forbundet med øget prævalens af MetS . Der er en omvendt sammenhæng mellem CVD og plasma HDL-C-niveauet, et af kriterierne for det metaboliske syndrom . Højdensitetslipoprotein, en underfraktion af cirkulatoriske lipoproteiner, spiller en vigtig rolle i kolesteroltransporten fra perifert væv til leverceller . HDL er rig på Apo A-I- og Apo A-II-proteiner, og mere end to tredjedele af dets indhold er Apo A-I .
ABC-transmembrantransportørerne spiller en vigtig rolle i kolesteroloptagelsen fra makrofager til HDL og mindsker dannelsen af skumceller . ABCA1 består af 2261 aminosyrer og findes i de fleste væv. I de seneste år er det blevet vist, at ABCA1 spiller en væsentlig rolle i beskyttelsen mod hjerte-kar-sygdomme . HDL-syntesen afhænger direkte af ABCA1-aktiviteten i levercellerne; med andre ord har den en nøglefunktion i arteriecellernes beskyttelse mod skumceller ved at øge plasma-HDL-indholdet. Arterielle makrofager ABCA1-aktivitet har vist en omvendt sammenhæng med skumcelledannelse, da med stigningen i dens aktivitet vil dannelsen af skumcelle mindskes .
Den reducerede eller nedsatte ABCA1-aktivitet kan forårsage nogle sygdomme såsom type 2-diabetes , Tangier-sygdom og tidlig CVD .
ABCG1-genet er placeret på kromosom 21q22.3 . Både ABCA1 og ABCG1 fører til reduktion af vævskolesterol ved dets udstrømning til HDL, men ABCG1 transporterer vævskolesterol til HDL2 og HDL3, mens ABCA1 transporterer det til lipidfri Apo A-I . Makrofager er det vigtigste væv for ABCA1- og ABCG1-virksomheden . I mange undersøgelser blev virkningerne af opregulering og nedregulering af disse gener undersøgt.
Reduceret kolesteroludstrømning er konsekvensen af manglende ABCA1-ekspression in vitro ; det kan føre til stigning i åreforkalkning , men opregulering af ABCA1 resulterer i reduktion af åreforkalkning . Nedregulering af ABCG1 har også de samme virkninger på kolesteroludstrømning, men der er kontroversielle resultater om virkningen af ABCG1-nedregulering på åreforkalkning .
I MetS ændres ekspressionsmønstrene for nogle gener, hvilket kan føre til fedme, diabetes og hypertension. I den foreliggende undersøgelse havde vi til formål at evaluere ABCA1- og ABCG1-genernes ekspression hos patienter med MetS, da disse gener er involveret i transportersyntesen, som har en afgørende rolle i kolesteroltransporten.
2. Materialer og metoder
2.1. Emner
Denne case-kontrolundersøgelse blev udført på patienter, der blev henvist til en endokrinologisk afdeling på et hospital i Hamadan (vest for Iran) i løbet af 2013-2014. Der blev udvalgt 36 patienter med metabolisk syndrom. Også 36 alders- og kønsmatchede raske personer blev udvalgt som kontrolgruppe. Ingen af de raske personer havde kriterierne for metabolisk syndrom.
Inklusionskriteriet i gruppen med metabolisk syndrom var, at de havde tre ud af fem af de ovennævnte karakteristika. Patienterne med anamnese om forbrug af antilipid-, præventions- og vanddrivende lægemidler blev udelukket fra undersøgelsen. De gravide patienter og patienter med diabetes, inflammation og infektion blev også udelukket.
2.2. Blodprøvetagning
En 2,5 mL blodprøve fra hver forsøgsperson blev tilsat til et EDTA-holdigt rør og blev opbevaret ved 4°C til RNA-udtrækning (højst to timer senere).
2.3. Ekstraktion af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er)
Lymphodex (Tyskland) og Henx (Iran) opløsninger blev anvendt til isolering af PBMC’er. Ca. 2 mL Henx-opløsning blev tilsat til samme mængde blod og blandet fuldstændigt; derefter blev det hældt forsigtigt og langsomt over i 3 mL Lymphodex-opløsning. Efterfølgende blev blandingen anbragt på Lymphodex og centrifugeret ved 1000 g i 20 minutter. Det mellemliggende hvide lag mellem plasma og Lymphodex blev isoleret som mononukleære celler (MC’er); derefter blev Henx-bufferen tilsat til MC’erne, blandet fuldstændigt og centrifugeret. Endelig blev supernatanten kasseres, og processen blev gentaget en gang til.
2.4. RNA-ekstraktion og cDNA-syntese
Nettoekstraktionen af RNA blev udført ved hjælp af Gene JET RNA Purification-kittet i henhold til producentens protokol. Kvaliteten og mængden af det rensede RNA blev analyseret ved hjælp af NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA); derefter blev integriteten af hver RNA-prøve undersøgt ved hjælp af 1% agarosegel, 1x TBE.
RNA’et blev konverteret til cDNA ved hjælp af RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) ved at følge protokollen: trin 1: primer annealing ved 25 °C i 5 minutter; trin 2: cDNA-syntese ved 42 °C i 60 minutter; trin 3: varmeinaktivering ved 70 °C i 5 minutter. Produkterne blev opbevaret ved -80 °C til de næste trin.
2.5. Primerdesign
De specifikke primere for hvert gen blev designet ved hjælp af Allele ID-software (version 7.6). For at øge specificiteten af realtids-PCR-reaktionen og reducere de falsk positive resultater blev et af hvert primerpar designet til at være knyttet til Exon-Exon-knudepunktet. De grundige kriterier for de anvendte primere for hvert gen er anført i tabel 1. Det 18S rRNA-husekeeping-gen blev anvendt som intern kontrol.
|
Den relative ekspression af generne blev beregnet ved at måle tærskelcyklus (CT)-værdien for hver prøve ved hjælp af C1000 Thermocycler og CFX96 realtidssystem (Bio-Rad, USA) og SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa nr. RR820L). Gennemsnittet af CT i tredobbelt analyse af hver prøve blev bestemt som CT-værdi. Ingrediensmængderne i qRT-PCR-reaktionen omfattede 10 μL SYBR-grønt, 7 μL afioniseret vand og 1 μL af hver af fremadrettet primer, omvendt primer og skabelon. qRT-PCR blev udført under disse betingelser: indledende aktivering ved 95 °C i 30 sekunder og derefter 40 cyklusser med følgende trin gentaget: denaturering ved 95 °C i 5 sekunder, annealing ved optimeret annealingstemperatur i passende varighed for hvert gen og forlængelse ved 72 °C i 30 sekunder, og til sidst blev dataene registreret ved at øge temperaturen fra 72 °C til 95 °C i 0,5 °C/0,05 sekunder. Derefter blev PCR-produkterne elektroforeset (på 1% agarosegel, 1x TBE) for at verificere specificiteten af amplikoner.
2.6. Evaluering af de biokemiske serumfaktorer
En blodprøve på to milliliter blev indsamlet fra hver forsøgsperson og centrifugeret ved 3000 rpm i 10 min. med henblik på serumseparation. Samlet kolesterol (TC), LDL-C, TG, FBS og HDL-C blev undersøgt ved hjælp af Pars Azmun (Iran) kit af Hitachi 911 (Tyskland).
2.7. Analyse og fortolkning af resultater
formel blev anvendt til analyse af den relative genekspression af metabolisk syndrom og kontrolgrupper. Effektiviteten af realtids-PCR blev beregnet for hvert gen ved hjælp af 10-2 fortynding; efterfølgende blev det opnåede antal placeret på følgende beregningsformel til måling af foldændringer af genekspression :SPSS V.16 software blev anvendt til statistisk analyse med 95 % konfidensintervaller. Normalfordelingen af variablerne blev kontrolleret ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov-metoden, og derefter blev værdierne sammenlignet mellem to grupper via uafhængige stikprøver -test.
3. Resultat
Demografiske karakteristika og biokemiske faktorer i de undersøgte grupper er præsenteret i tabel 2. Mand/kvinde-forholdet var 1/3 i hver gruppe (12 M og 24 F). Som det fremgår af tabel 2, var forskellene i alle undersøgte parametre statistisk signifikante mellem de to grupper () med undtagelse af alder og LDL-C. Gruppen med metabolisk syndrom havde højere BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, diastolisk/diastolisk blodtryk og taljeomkreds sammenlignet med raske personer, mens HDL-C var signifikant lavere i gruppen med metabolisk syndrom.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BMI: Body Mass Index; FBS: Fast Blood Sugar; TG: Triglycerid, HDL-C: High density lipoprotein-cholesterol; LDL-C: Low density lipoprotein-cholesterol; signifikant forskel. |
3.1. Resultater af qRT-PCR
Efter afslutning af PCR-reaktionen blev resultaterne verificeret ved analyse af reaktionskurven, smeltekurven for produkterne og elektroforese af PCR-produkterne. Elektroforese blev udført på 1 % agarose med en 100 bp DNA-stige. Resultaterne er vist i figur 1.
3.2. Evaluering af genekspression i PBMC
Ekspressionsniveauerne for generne blev målt i de mononukleære celler i perifert blod og sammenlignet mellem to grupper ved beregning af ΔCT for hvert gen. Der var ingen forskel i ABCA1-ekspressionen mellem de to grupper, men ABCG1-ekspressionen var signifikant lavere i MetS-gruppen (). De detaljerede resultater er vist i tabel 3.
|
||||||||||||||||||||||||||
Signifikant. |
Også beregningen af foldændring i ABCG1-ekspression () viste 3,1 gange lavere ekspression i MetS-gruppen.
4. Diskussion
ABCA1 og ABCG1 har en afgørende rolle i kolesterol omvendt transport fra perifere væv såsom makrofager til leveren . Imidlertid er ABCA1 og ABCG1 genernes ekspression blevet undersøgt i nogle sygdomme; vi har ikke fundet nogen rapport om dette emne i forbindelse med metabolisk syndrom. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af disse gener hos personer med metabolisk syndrom og raske personer.
Mens der ikke var nogen signifikant forskel i ABCA1-genekspressionen mellem de to undersøgte grupper, fandt vi en signifikant lavere ekspression (ca. 75 %) af ABCG1 hos personer med metabolisk syndrom sammenlignet med kontrolgruppen. Singaraja et al. viste, at den reducerede ABCA1 i makrofager og nyrer er forbundet med øget kolesterolindhold . De konkluderede, at nedsat ABCA1-medieret kolesteroleksport kunne bidrage til den øgede åreforkalkning og nefropati i forbindelse med diabetes . Der er nogle rapporter, der forsøger at undersøge de mulige mekanismer, der regulerer ekspressionen af disse gener. For nylig er det blevet vist, at polymorfismer i ABCA1 og ABCC8 kan være forbundet med metabolisk syndrom . Der er beviser for, at forstyrrelser i ABCA1-funktionen, som kan skyldes mutationer i dette gen, kan føre til familiær hypoalipoproteinæmi, som er karakteriseret ved lavt HDL-indhold og øget aflejring af kolesterylestere i flere væv og celler . Det er også blevet vist, at overekspression af ABCA1-genet kan give beskyttelse mod åreforkalkning . Disse data er i overensstemmelse med vores resultater og understøtter denne idé om, at lavere ekspression af ABCA1-genet kan bidrage til komplikationer i forbindelse med metabolisk syndrom.
Haghpassand et al. viste, at ABCA1-genekspression i PBMC’er har en direkte sammenhæng med kolesterolbelastningen, og overekspression af ABCA1 fører til overførsel af det overskydende kolesterol til apoproteinerne . Wang et al. undersøgte den omvendte kolesteroltransport i ABCA1 og ABCG1 knockdown mus og konkluderede, at når både ABCA1 og ABCG1 blev slået ned, er der større omvendt kolesteroltransport sammenlignet med ABCG1 knockdown .
Da Mauerer et al. påpegede, at det høje niveau af glukose (hyperglykæmi) er involveret i reduceret ABCA1 og ABCG1 ekspression in vitro , synes det logisk at forvente lignende ændringer i MetS . Promotorer af ABCA1 og ABCG1 har receptorsted for LXR og RXR; når oxycholesterol og retinsyre slutter sig til disse faktorer, øges ekspressionen af ABCA1 og ABCG1. Desuden er cAMP og NFκB transkriptionelle faktorer for henholdsvis ABCA1 og ABCG1.
De opnåede resultater viste et signifikant fald i ABCG1-ekspressionen hos patienter med metabolisk syndrom sammenlignet med raske personer. Disse resultater tyder på, at hyperglykæmi, relaterede metabolitter og hyperlipidæmi over transportørkapaciteten kan føre til nedsat ekspression af ABCG1. Da der ikke blev observeret nogen signifikant ændring i ABCA1-genekspressionen, kan det skyldes en anden reguleringsmekanisme. Da strukturerne af disse gener er forskellige, og de reguleres af forskellige transkriptionelle faktorer, kan vores resultater begrundes . Ikke desto mindre er det begrænsede antal prøver i denne undersøgelse en anden faktor for fraværet af ændringer i ABCA1-ekspressionen.
Det andet punkt er, at vi undersøgte ekspressionen af disse gener i PBMC hos de undersøgte personer; det er vigtigt at bemærke, at ændringerne i ekspressionen af disse gener i monocytter kan være anderledes end i de andre nøglevæv som lever og tarm, som er de vigtigste steder for HDL-syntese. Desuden indebærer ændringerne i mRNA-niveauer ikke nødvendigvis ændringer i det relaterede protein.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Akkreditering
Denne artikel er uddraget fra Zahra Tavoosis kandidatafhandling. Forfatterne vil gerne takke Hamadan University of Medical Sciences for økonomisk støtte til denne undersøgelse.