Selv om proteinanalyser har en række forskellige anvendelser i biovidenskabelig forskning, er der ikke en enkelt analysemetode, der er egnet til alle anvendelser. På trods af alle fremskridt inden for moderne videnskab findes der ikke en proteinanalysemetode, som ikke påvirkes af andre komponenter end proteiner eller af forskelle i proteinsammensætningen. Af denne grund finder proteinlaboratorier det nødvendigt at have mere end én type proteinassay til forskningsformål.
Hver assay har sine egne fordele og begrænsninger. Hvis du ønsker at få nøjagtige resultater fra dit eksperiment, skal du derfor kunne vælge det bedst egnede assay til din anvendelse.
Typer af kolorimetriske proteinassays
Baseret på den involverede kemi er de to mest almindelige metoder til kolorimetrisk påvisning og kvantificering af totalprotein den proteinfarvestofbindende assay og/eller kobberionbaserede chelatassay.
Farvestofbindingsanalyser
Farvestofbindingsanalyser, såsom Bradford- (Coomassie) og 660nm-proteinanalyser, er baseret på binding af proteinmolekyler til Coomassie-farvestof under sure forhold. Når proteinmolekylerne binder sig til farvestoffet, skifter farven fra brun (Amax= 465nm) til blå (Amax= 610nm). Ændringen i farvetætheden (som aflæses ved 595nm) er proportional med proteinkoncentrationen.
De basiske aminosyrer (arginin, lysin og histidin) spiller en afgørende rolle for dannelsen af farvestof-protein-komplekser og den deraf følgende spektrale forskydning, mens mindre proteiner (mindre end 3kDa) og aminosyrer ikke giver farveændringer.
Kobberionbaserede analyser
I kobberionbaserede proteinanalyser blandes proteinopløsningen med en alkalisk opløsning af kobbersalt for at lette kelatdannelsen af kobberioner (Cu2+) med peptidbindingerne og den efterfølgende reduktion af kobberionerne (Cu2+) til kobberioner (Cu+). Eventuelle overskydende kobberioner vil forblive ubundne til peptidbindingerne og vil være tilgængelige for detektion.
Proteinassays baseret på kobberioner kan opdeles i to grupper – (1) assays, der påviser reducerede kobberioner (Cu+) og (2) assays, der påviser ubundne kobberioner (Cu2+). Bicinchoninsyre (BCA) eller Folin-reagens (phosphomolybdic/phosphotungstic acid) kan anvendes til påvisning af cuprous-ioner. Ved reduktion af det anvendte reagens dannes der en blå farve. Den producerede farvemængde kan aflæses ved 650nm til 750nm og er proportional med mængden af peptidbindinger.
OBS: Tilstedeværelsen af tyrosin, tryptofan, cystein, histidin og aspargininin i protein øger den resulterende farvetæthed.
I assays, der er baseret på påvisning af ubundne kobberioner, blandes alkalisk kobber med proteinopløsningen, og de ubundne kobberioner påvises derefter med et farvelæggende reagens, der reagerer med kobberioner. Den producerede farvemængde er omvendt proportional med mængden af peptidbinding i prøven.
Valg af proteinanalyser: Nogle faktorer at overveje
Der er en række faktorer, som du bør overveje, når du vælger et assay. Her er nogle af dem.
- Kompatibilitet med prøvetype og komponenter. Proteinprøvens art og tilstedeværelsen af ikke-proteinstoffer i proteinopløsninger kan påvirke resultaterne af dit forsøg betydeligt. Husk, at tilstedeværelsen af reduktionsmidler, metalchelateringsmidler, farvestoffer, aminer og sukkerstoffer forstyrrer kobberbaserede proteinassays, mens proteinopløsninger, der indeholder detergenter, forstyrrer de farvestofbaserede proteinassays.
- Assayområde og påkrævet prøvevolumen. De fleste kolorimetriske assays kræver mindst 0,5 µg proteiner for at opnå et pålideligt estimat. For prøver, der er vanskelige at fremskaffe, bør man derfor overveje metoder, der kræver den mindste mængde prøve for at opnå et pålideligt estimat.
- Protein-til-protein ensartethed. Farvestofbaserede proteinanalyser og analyser, der involverer reduktion af kobberioner til kobberioner, har en betydelig protein-til-protein-variation.
- Tidsovervejelser. Prøvens kompleksitet og den valgte assaymetode dikterer den tid, du har brug for til at udføre din proteinassay. Proteinprøver, der indeholder interfererende stoffer, og assays, der anvender standardplots eller kurver, vil tage mere tid.
- Krav til instrumentering. Tilgængeligheden af det spektrofotometer eller den pladelæser, der er nødvendig for at måle den farve, der produceres (absorbans) ved assayet, kan også påvirke dit valg.
