Procedure
Prospektive deltagere blev vurderet med strukturerede interviewinstrumenter for at afgøre, om de kunne indgå i undersøgelsen. Spørgeskemaet om akademisk og medicinsk historie (20) blev brugt til at indhente demografiske oplysninger og oplysninger om akademisk præstation, nuværende og tidligere medicinske tilstande samt medicin- og stofbrug. Personer med diabetes, stofmisbrugsforstyrrelser eller diagnosticerede psykiatriske eller neurologiske tilstande blev udelukket, ligesom personer, der brugte medicin, der kunne påvirke resultatmålingerne, såsom benzodiazepiner. Niveauet af hukommelsesforringelse blev bestemt ved hjælp af Clinical Dementia Rating (CDR), som indhenter oplysninger fra deltageren og en informant (typisk ægtefælle eller voksent barn) om arten og omfanget af kognitiv svækkelse som manifesteret i daglige aktiviteter i hjemmet og i samfundet (21). Områderne hukommelse, orientering, problemløsning, samfundsforhold, aktiviteter i hjemmet og personlig pleje blev vurderet, og vurderingerne for hvert område bidrog til en global CDR-klassifikation, hvor hukommelsesområdet blev vægtet tungest. CDR-klassificeringerne omfatter ingen svækkelse, let svækkelse og let, moderat og svær demens. Vi indskrev personer med let svækkelse svarende til mild kognitiv svækkelse og udelukkede personer med CDR-klassifikationer, der angiver ingen svækkelse, og personer med mild, moderat og svær demens. Ud over den globale CDR-klassifikation blev der også udledt en sum af kasser score. Denne score repræsenterede den aritmetiske sum af kategoribedømmelserne på tværs af de seks funktionsdomæner og tjente som et middel til at kvantificere det overordnede niveau af funktionel tilbagegang (22).
Vild blåbærsaft blev kommercielt fremstillet af modne, frosne vilde (lowbush) blåbær (Vaccinium angustifolium Aiton) af Van Dyk’s Health Juice Products Ltd (Caledonia, Nova Scotia, Canada) og blev stillet til rådighed for denne forskning af Wild Blueberry Association of North America, Old Town, ME, USA. Bærrene blev optøet, presset, filtreret, pasteuriseret og derefter aftappet i ravfarvede glasflasker på 1 liter. Et kg blåbærfrugter gav ca. 735 mL saft med enkeltstyrke.
Der blev foretaget analyser af prøver af den saft, der blev anvendt i denne undersøgelse. De hyppigst forekommende opløste komponenter i saften af vilde blåbær var glukose, fruktose samt æble- og citronsyre (23). Kolorimetrisk måling af de samlede phenoler i saften viste en koncentration på 2,38 g gallicsyreækvivalenter/L (24). De vigtigste phenoler i saften var hydroxycinnaminsyreesteren, chlorogensyre på ca. 734 mg/L og flavonoidantocyaniner på 877 mg cyanidin 3-glucosidækvivalenter/L saft baseret på HPLC-analyse som beskrevet andetsteds (25). Der kan forekomme tab af anthocyaniner og andre phenolstoffer i blåbærsaft under opbevaring. I løbet af de ca. tre måneders opbevaring af juiceprøverne blev tabet af de samlede phenoler og anthocyaniner bestemt til henholdsvis 23 % og 20 % for juice, der blev opbevaret under køling i ravfarvede flasker.
Dagligt forbrug blev holdt mellem 6 mL/kg og 9 mL/kg ved hjælp af en doseringsskema bestemt af kropsvægt. Personer, der vejede 54 til 64 kg, fik ordineret 444 mL/dag, personer, der vejede mellem 65 og 76 kg, fik 532 mL/dag, og personer, der vejede mellem 77 og 91 kg, fik 621 mL/dag. Tabel 1 indeholder data om phenol- og anthocyaninindtag bestemt fra prøver af den blåbærsaft, der blev anvendt i denne undersøgelse. Dette doseringsinterval svarede til den mængde, der blev anvendt i forsøg på mennesker med Concord-druesaft (19,26). Deltagerne i undersøgelsen var blinde for det supplement, de fik, og fik at vide, at undersøgelsesproduktet kunne være druesaft, blåbærsaft eller en bærplacebodrik. Saften blev opbevaret i et kølerum ved 4 °C inden uddeling. Forsøgspersonerne blev instrueret om at afkøle juicen derhjemme og indtage de foreskrevne daglige mængder i lige store, opdelte doser til morgen-, middags- og aftenmåltiderne. Vi leverede beholdere med individuelle doser markeret for hver forsøgsperson for at minimere risikoen for fejlmåling. Interventionsperioden var på 12 uger. På trods af at dette repræsenterede en meget mindre procentdel af den samlede levetid for mennesker end for gnavere, forventede vi, at det biologiske respons ville indtræffe inden for stort set samme tidsramme i betragtning af overensstemmelsen mellem tidligere undersøgelser af mennesker og dyr. Tilskud af blåbær i lignende tidsrammer i forsøg med ældre dyr har vist forbedringer af kognitive præstationer (12,14). Desuden har forsøg på mennesker af denne varighed med bærsaft vist gavnlige ændringer i inflammatoriske markører og antioxidantkapacitet (26).
Tabel 1
Dagligt indtag af blåbærsaft efter vægt, samlede phenoler og anthocyaniner.
Kropsvægt, kg | Indtagelse af blåbærsaft, mL/d | Fenoler, g gallinsyre-ækv. | Anthocyaniner, g cyanidin 3-glucosid-ækv. |
---|---|---|---|
54-64 | 444 | 1.056 | 0.428 |
65-76 | 532 | 1.266 | 0.512 |
77-91 | 621 | 1.478 |
Personerne fik flaskejuice ved baselinebesøget og ved et midtvejsbesøg i uge 6 af interventionen. Overholdelse af forbrugsprotokollen og bivirkninger blev vurderet ved ugentlige telefonkontakter og ved direkte interview under de mellemliggende og afsluttende besøg. Forsøgspersonerne blev instrueret om at undgå bærfrugter og -juice samt bærekstrakter i hele forsøgsperioden og fik en liste over fødevarer og kosttilskud, som de skulle undgå. Denne liste omfattede frugter og drikkevarer som bl.a. blåbær, brombær, kirsebær, druer, druesaft, granatæbler, jordbær og vin.
Vurderinger blev udført ved baseline før behandlingen og i den sidste uge af interventionen. De primære resultater var målinger af hukommelsesfunktion, herunder Verbal Paired Associate Learning Test (V-PAL; 27) og California Verbal Learning Test (CVLT; 28). Parrede associerede opgaver har identificeret dem med progressiv neurodegeneration og vist følsomhed over for tidlig og mere avanceret Alzheimers sygdom (29), og V-PAL har vist sig at være følsom over for udviklingsmæssige præstationsændringer mellem unge, midaldrende og ældre kvinder (30). Denne opgave kræver, at forsøgspersonen skal lære nye associationer mellem almindelige en- og to-stavelses semantisk ubeslægtede ord (f.eks. help-years). V-PAL-præstationsscoren repræsenterer det kumulative antal korrekte svar summeret på tværs af fire indlærings- og testforsøg. CVLT er en meget anvendt opgave til indlæring og genkaldelse af lister, som har vist sig at være følsom over for aldersrelaterede hukommelsesændringer, MCI og demens (31). Den omfatter en liste med 16 punkter med almindelige ord, der kan grupperes i semantiske kategorier. Der er dog ikke noget krav om at indkodde nye associationer. Den frie tilbagekaldelsesscore blev brugt til at vurdere ordlistens fastholdelse. Begge disse verbale hukommelsestests blev medtaget, fordi de medfører noget forskellige kognitive krav. Mens V-PAL-testen kræver dannelse af nye associationer, indebærer CVLT-testen tilegnelse og fastholdelse af en liste over individuelle ord. Begge er afhængige af hippocampal behandling, selv om opgaven med parrede associationer kan være mere ressourcekrævende og potentielt mere følsom over for kognitive aldringseffekter (32).
Alternative former af hver hukommelsesopgave blev anvendt ved baseline- og slutbesøgene, således at det specifikke testemneindhold ikke blev gentaget. Brugen af alternative former afbøder i væsentlig grad øvelsesvirkninger, der er forbundet med test-retest-designs, især med hensyn til hukommelsestests (33). Alternative former kan dog muligvis ikke eliminere præstationsforøgelse ved gentest relateret til proceduremæssige øvelsesvirkninger; dvs. fortrolighed med testproceduren (34).
Modet blev vurderet med Geriatric Depression Scale (GDS; 35), en opgørelse med 30 punkter, der er designet til at evaluere symptomer på depression hos ældre voksne. Vi målte også vægt og taljeomkreds og fik fastende blodprøver til bestemmelse af serumglukose- og insulinværdier af biokemilaboratoriet på General Clinical Research Center (GCRC) ved University of Cincinnati.
De primære statistiske analyser omfattede afhængige t-tests for at bestemme ændringen fra baseline til det sidste besøg i hukommelsespræstationer, humør, kropsantropometri og metaboliske parametre. Vi satte α-sandsynligheden for type 1-fejl til 0,05 for at rapportere statistisk signifikante effekter. I betragtning af den foreløbige karakter af dette forsøg rapporterede vi tendenser ved α ≤ 0,10. Vi beregnede også Cohen’s d-effektstørrelsesstatistikker (36) for disse analyser, som er karakteriseret som små (0,2), mellemstore (0,5) og store (0,8).
På grund af bekymring vedrørende præstationsforøgelse med gentagne hukommelsestestest, udførte vi også analyser af kovarians (ANCOVA) for at kontrollere for potentielle proceduremæssige praksisvirkninger ved at sammenligne hukommelsespræstationer af blåbærprøven med præstationer af drue placeboprøven fra den ledsagende undersøgelse. Disse analyser isolerede effekten af interventionen ved at bruge resultatscorer fra det endelige besøg som den afhængige foranstaltning og den tilsvarende score fra baselinebesøget som kovariant foranstaltning (37). Cohen’s f (36) repræsenterer effektstørrelsesstatistikken for disse analyser, som er små (0,1), mellemstore (0,25) og store (0,40).