Nye teknikker til isolering af mikroorganismer med vægt på laserprint | CDhistory

Nye isoleringsmetoder

I dag anvendes en lang række forskellige metoder til at afdække nye, tidligere ukultiverede mikroorganismer. Navnlig anvendes nye næringsmedier, der indeholder specifikke stoffer, og dyrkning foregår under forskellige fysiske og kemiske miljøforhold, f.eks. atmosfærisk sammensætning, temperatur og pH-værdi. Endvidere er anvendelsen af fortyndede næringsmedier i kombination med lange inkubationsperioder samt fælles dyrkning af mikroorganismer af forskellige arter blevet undersøgt. I de senere år er der blevet udviklet nogle grundlæggende nye dyrkningsmetoder baseret på placering af mikroorganismer i det naturlige miljø uden brug af næringsmedier. Sådanne metoder anvender diffusionskamre og polymerbelægninger, hvori mikrobielle celler anbringes. I dette tilfælde modtager mikroorganismerne alle de nødvendige næringsstoffer fra det naturlige miljø og forbliver isoleret fra det. Tildelingen af en ny antibiotikaproducent (teixobactin) ved hjælp af sådanne metoder anses for at være en vigtig præstation. En anden fremgangsmåde omfatter samtidig dyrkning og screening af titusindvis og hundredtusindvis af bakterielle mikrokolonier på porøse polymer- eller keramiske isoleringschips. Til dyrkning af “ukulturerbare” mikroorganismer kan man også anvende metoder, der gør det muligt at isolere enkeltceller fra naturlige miljøer. Blandt disse metoder er de mest populære baseret på fortynding af mikroorganismesuspension, flowcytometri og cellesortering, lasermikrodissektion, kompartmentalisering og anvendelse af mikromanipulatorer. Ud over dyrkning af hidtil ukultiverede arter af mikroorganismer er isolering af enkelte mikrobielle celler nødvendig til undersøgelse af cellens fysiologi, interaktioner mellem celler samt til søgning efter nye metabolitter som f.eks. antibiotika og enzymer.

De moderne videnskabelige og teknologiske fremskridt giver mange muligheder med hensyn til udvikling af nye metoder til dyrkning, isolering, manipulation og undersøgelse af individuelle bakterieceller og deres konsortier. Nye metoder kan fremskynde arbejdet med mikroorganismer betydeligt og gøre det muligt at gennemføre mere fuldstændige og omfattende undersøgelser af dem. Det skal bemærkes, at der hidtil kun er blevet foreslået meget få metoder til positionering af bakteriearrays med mikrometerpræcision. I Akselrod et al. blev der dannet tredimensionale (3D) netværk af levende celler i hydrogel uden tab af deres levedygtighed ved hjælp af arrays af multiplexede holografiske optiske fælder (pincetter) med en hidtil uset nøjagtighed (<400 nm). Til at danne optiske fælder blev der anvendt to lasere: Ar+ laser (20 W, 514 nm bølgelængde) og en Ti: Safir-laser med kontinuerlig bølge, der kan indstilles i området λ = 850-900 nm, samt en kombination af to diffraktionselementer, kombineret med forskellige linser i et inverteret optisk mikroskop. Der blev dannet netværk af 3T3 fibroblaster omgivet af en ring af bakterier. Evnen til at manipulere hundredvis af Pseudomonas aeruginosa-bakterier samtidig i todimensionale (2D) og 3D-arrays blev også demonstreret. Metoden til holografisk optisk fældefangst er meget præcis, men teknisk vanskelig at udføre.

I undersøgelsen af Rowan et al. foreslås metoden til heterogen funktionalisering af overflader, som er en litografisk proces i fire trin baseret på mikrokontaktprintning af organiske monolag, implantation af hyperforgrenet polymer og yderligere funktionalisering heraf. Som et resultat heraf opnås strukturer, hvorpå der foretages en målrettet inokulering af bakterieceller. Undersøgelser af cellernes overlevelse har vist, at cellerne forbliver levedygtige på de opnåede strukturerede overflader. Der blev opnået store bakterieisolater indeholdende 18 ± 5 bakterier og små isolater indeholdende 2 ± 1 bakterie. Ifølge denne artikel kan den demonstrerede metode anvendes til screening og biosensing med høj gennemløbskapacitet. Det er imidlertid vanskeligt at kombinere den heterogene funktionalisering af overflader ved hjælp af denne metode med rutinemæssig biologisk forskning og betingelserne for dyrkning af mikroorganismer (temperatur, pH, næringsstoffer osv.). Det er nødvendigt at bemærke, at opgaven med at finde enkle metoder til at give høj opløsning af levende bakteriearrays med mulighed for forskellige biologiske undersøgelser blev løst i nogle publikationer. De metoder, der foreslås i disse værker, er faktisk forløbere for 3D-printning.

I en undersøgelse af Weibel et al. blev teknikken med stempling af levende bakterier på agaroseplader foreslået. Der blev udskrevet bakteriearrays (størrelsen af en enkelt plet med bakterier >200 µm) i et område på op til 50 cm2. Polydimethylsiloxan (PDMS)-stempler blev fremstillet ved hjælp af fotolitografisk teknik. Den opnåede minimumsstørrelse af trykfremspringet var 190 µm ved en højde på 140 µm, hvilket dog langt fra er den størrelse, der kræves for at adskille bakterier. Denne metode er hurtig, reproducerbar og praktisk og kan bruges til at kontrollere mønsteret, afstanden og orienteringen mellem kolonier af forskellige bakterier. I Xu et al.s undersøgelse blev levende bakterier med cellulær opløsning trykt på agarosesubstratet ved hjælp af elastomere (PDMS) stempler med et højt aspektforhold, som blev fremstillet ved hjælp af RISL-metoden (reverse in situ lithography). Figur 1 viser fordelene ved RISL-metoden i forhold til standard ultraviolet fotolitografi. Den eneste begrænsning ved RISL-teknologien er fremspringets diameter, som næppe kan være <1 µm på grund af den optiske diffraktionsgrænse.

Metoden til mikrokontaktprintning af bakteriearrays fungerer på følgende måde: Dråben af Escherichia coli i kulturmediet LB deponeres på agarosegel (3 vægtprocent i LB), og på agarosesubstratet dannes et monolag af bakterier (væsken absorberes af agarosegel). Derefter kommer PDMS-stemplet i kontakt med et monolag af bakterier, der dækker agarosegelen. Stemplet fjernes, og den del af bakterierne forbliver på det. Ved stemplets kontakt med laget af agarosegel (4 wt% i LB, tykkelse 200 µm) overføres bakterierne til agaroselaget. På få sekunder kan der således på et stort område (cm2 ) trykkes arrays af E. coli-bakterier direkte på agarosesubstratet med mikronopløsning og op til enkelte bakterier. Det blev vist, at bakterierne, efter at mønstret er trykt, fortsætter med at vokse og dele sig som i en massekultur, dvs. at bakterierne bevarer deres normale fysiologiske adfærd efter trykning. Det blev også vist, at agarosekoncentrationen er afgørende for en god printpræstation. En for lav koncentration fører til en forvrængning af det trykte mønster, mens en for høj koncentration ikke er egnet til bakteriedyrkning. For at opnå arrays af enkeltbakterier blev virkningen af en reduktion af den oprindelige bakteriekoncentration i en dråbe af kulturmediet LB undersøgt. For de indledende koncentrationer på 109 og 108 celler/ml blev det gennemsnitlige antal bakterier pr. plet målt til henholdsvis 12,1 og 1,4. Der blev opnået en meget snæver fordeling ved den lave koncentration af bakterier: 44,6 % af pletterne havde kun én E. coli-celle, og 40,1 % af pletterne havde 0 eller 2 celler. Disse resultater viste, at mikrokontaktprintning gør det muligt at fremstille regelmæssige arrays af enkeltbakterier. Desuden blev det vist, at denne fremgangsmåde til adskillelse af bakteriearrays gør det muligt at analysere vækstraterne for de enkelte bakterielinjer. Denne metode giver en enkel måde til enhver ønsket rumlig 2D-fordeling af bakterier og kan bruges til både screening og undersøgelser af bakteriel fænotypisk variation, populationsdynamik og evolution af økosystemer.

Et område i hastig udvikling – sociomikrobiologi – har identificeret de mekanismer, ved hjælp af hvilke bakterier deltager i samarbejds- og konkurrenceforhold ved at påvirke naboer i nærheden gennem fysisk kontakt og ændring af den kemiske sammensætning af deres fælles mikromiljø. For at undersøge adfærden hos små mikrobielle aggregater er der udviklet forskellige mikroprocesseringsteknologier, der begrænser bakterier i mikrofluidiske anordninger, mikroresonatorer og væskedråber med ultra-lavt volumen. Evnen til at integrere analytiske systemer med mikrofluidik har gjort disse isolationsplatforme attraktive til højtydende screening for antibiotikaresistens og analyse af enzymatisk aktivitet. Eun et al. beskriver f.eks. en højtydende analyse og isolering af bakterieceller indkapslet i agarosemikropartikler ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Der blev anvendt mikrofluidiske systemer med strømfokusering til at skabe monodisperse mikropartikler med en diameter på ≈30 µm. Størrelsen af disse partikler gjorde dem kompatible med flowcytometri og FACS, og følsomheden af disse metoder reducerede inkubationstiden for cellereplikation før udførelse af analyserne. Mikropartiklernes lille volumen (≈1-50 picoliter ) minimerede antallet af reagenser, der var nødvendige for bakterieundersøgelser. Denne platform gjorde det muligt at allokere og isolere bakterier effektivt, samt at anvende kombinationen af metoder til hurtig identifikation af mål for biologisk aktive små molekyler. Som en eksperimentel demonstration af denne metode blev E. coli-celler indkapslet i agarosemikropartikler, inkuberet i nærvær af forskellige koncentrationer af rifampicin og analyseret ved hjælp af FACS. Den mindste inhiberende koncentration af rifampicin blev bestemt, og spontane mutanter, der havde antibiotikaresistens, blev isoleret ved hjælp af FACS og karakteriseret ved DNA-sekventering. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev den tid og den mængde antibiotika, der var nødvendig for at isolere mutanter, reduceret med henholdsvis 8 og 150 gange i forhold til traditionelle mikrobiologiske metoder med anvendelse af næringsstofagarplader. Denne metode er således vigtig inden for kemisk biologi, kemi af naturprodukter samt til opdagelse og karakterisering af biologisk aktive sekundære metabolitter.

De ovennævnte metoder har været nyttige til at begrænse størrelsen, formen og de fysiske egenskaber (mikrohabitat); ingen af dem har dog givet mulighed for at bestemme bakterieaggregaternes 3D-geometri eller orienteringen af flere populationer vilkårligt. Desuden begrænser processen med celleindkapsling i hulrum med ultra-lavt volumen ofte massetransporten, hvilket fører til forhold, der er uforenelige med vækst og signalering mellem fysisk isolerede populationer. Et stigende antal beviser fremhæver vigtigheden af mikrokolonier i bakteriel reproduktion; der er imidlertid mangel på værktøjer til systematisk vurdering af celleadfærd i sådanne samfund. Nye strategier til skabelse af et 3D-kulturmiljø på mikroskopisk skala kan spille en afgørende rolle i identifikationen af, hvordan bakterier håndterer antibiotikaresistens og anden social adfærd i små tætte aggregater.

I Connell et al. og Connell et al. beskrives metoden til laserdannelse af mikroskopiske 3D-kamre baseret på multiphoton lithografi (MPL). MPL-metoden har en høj gennemløbskapacitet og mulighed for at fremstille vilkårlige mønstre. Den giver muligheder for industriel produktion af 3D-mikroenheder som f.eks. mikrooptiske komponenter, stilladser til vævsteknologi og mikrofluidiske chips. I Connell et al.s undersøgelse blev bovin serumalbumin (BSA), et meget opløseligt protein, der kan krydsforbindes til porøse, holdbare og biokompatible hydrogeler, anvendt til at skabe mikroskopiske 3D-bakteriekamre. Nogle separate bakterier blev lukket inde i BSA-kamrene med et volumen på 1 pl og blev derefter dyrket i klonale populationer. På grund af diffusionen af biologisk betydningsfulde molekyler og antibiotika gennem BSA-væggene samt udvekslingen af quorumfølsomme signaler blev bakteriesamfundenes sociale adfærd undersøgt i forhold til befolkningens størrelse og tæthed, beholderens form og miljøets strømningshastighed.

I menneskekroppen findes bakterier normalt i strukturerede 3D-samfund bestående af flere bakteriearter. For at få detaljerede oplysninger om geometriens indvirkning på patogenicitet beskrives en 3D-printstrategi i Connell et al. for bakteriesamfund, hvor fysisk adskilte, men kemisk interaktive populationer af en bestemt størrelse, form og tæthed kan organiseres i en hvilken som helst form i det væsentlige (figur 2). Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev det vist, at en enkelt patogen bakteriearts stabilitet over for antibiotika kan øge resistensen hos den anden bakterieart på grund af deres 3D-relationer. Ved hjælp af laserlitografisk teknik blev der dannet mikroskopiske beholdere på op til 1 pl volumen med en vægtykkelse på op til 2 µm omkring udvalgte bakterier suspenderet i gelatine ved tværbinding af polypeptidmolekylerne i fokusområdet som følge af ikke-lineær absorption af laserstråling fra fotosensibilisatormolekyler. Resultatet af denne multiphotonabsorption er dannelsen af singlet oxygen, som stimulerer intramolekylære og intermolekylære kovalente krydsforbindingsreaktioner mellem BSA og gelatine. Gelatins unikke fysiske og kemiske egenskaber har motiveret interessen for dets anvendelse til en række forskellige formål, herunder opbevaring, immobilisering og 3D-dyrkning af bakterier. Efter fjernelse af det overskydende reagens lokaliseres bakterierne i forseglede hulrum dannet af krydsbundet gelatine, som er et meget porøst materiale, der understøtter en hurtig vækst af fuldt lukkede cellepopulationer. Det er let gennemtrængeligt for polypeptider, antibiotika og for de fysiske og kemiske signaler, ved hjælp af hvilke interaktion mellem bakterier finder sted. Isolering af celler i mikrobeholdere giver mulighed for indlejring af forskellige typer/densiteter af beholdere i hinanden, samt for dynamiske ændringer i orienteringen af hele bakteriepopulationer i samfundet.

Forfatterne har vist, at rumligt lokaliserede interaktioner mellem de grampositive Staphylococcus aureus og de gramnegative P. aeruginosa-bakterier (to humane patogener, der ofte danner vedvarende co-infektioner inde i sår, katetre og lunge hos patienter med mucoviscidose) kan øge Staphylococcus’ overlevelse ved behandling med β-lactam-antibiotika.

Mikro-3D celleprinting udvider fundamentalt mulighederne for sondering af antibiotikaresistens, når en enkelt bakteriel mikrogruppe kan påvirke antibiotikafølsomheden hos tilstødende omgivende eller indlejrede populationer – et spørgsmål af særlig relevans for in vivo-infektioner (f.eks, sår, mundhule og cystisk fibrose i lungerne), hvor væv ofte er koloniseret af flere arter af bakterier samtidig. Den sande styrke ved 3D-celleprintning ligger i evnen til at organisere de mikrobielle samfund i et ubegrænset udvalg af geometrier. Mikro-3D celleprintning kan også være et værdifuldt værktøj til undersøgelser af mekanismer og dynamikken i de adaptive reaktioner på miljøforhold.