3D-printede bioniske ører | CDhistory

Design og implementering af bioniske organer og anordninger, der forbedrer menneskets evner, kendt som kybernetik, har været et område af stigende videnskabelig interesse.1,2 Dette område har potentiale til at generere tilpassede erstatningsdele til menneskekroppen eller endda skabe organer med evner, der ligger ud over, hvad den menneskelige biologi normalt giver. Navnlig kan udviklingen af metoder til direkte multidimensionel integration af funktionelle elektroniske komponenter med biologisk væv og organer få en enorm betydning for regenerativ medicin, proteser og grænseflader mellem menneske og maskine3,4 . For nylig har flere rapporter beskrevet koblingen af elektronik og væv ved hjælp af fleksible og/eller strækbare plane enheder og sensorer, der tilpasser sig vævsoverfladerne, hvilket muliggør anvendelser som f.eks. biokemisk aftastning og undersøgelse af elektriske aktiviteter på overflader af hjertet,5 lunger,6 hjerne,7 hud8 og tænder.9 Det er imidlertid en betydelig større udfordring at opnå sømløse, tredimensionelt sammenflettede elektroniske komponenter med biologiske væv og organer.4

Tissue Engineering bygger på princippet om, at en række forskellige celletyper kan overtales til at syntetisere nyt væv, hvis de udsås på et passende tredimensionelt hydrogel-stillads i et passende vækstmiljø.10-15 Efter in vivo- eller in vitro-kultur dannes der vævsstrukturer, som har samme morfologi som det oprindelige stillads.16 En stor udfordring i traditionelle vævsteknologiske tilgange er imidlertid at frembringe celleseedede implantater med strukturer, der efterligner det oprindelige væv, både hvad angår anatomiske geometrier og intravævs cellulære fordelinger.17 Teknikker såsom seedning af celler i ikke-klæbende forme eller selvfoldende stilladser er blevet anvendt til at fremstille tredimensionelle vævskonstruktioner med komplekse 3D-geometrier.18,19 Alligevel er de eksisterende teknikker stadig ikke i stand til nemt at skabe organ- eller vævsdele med de nødvendige rumlige heterogeniteter og nøjagtige anatomiske geometrier for at imødekomme manglen på donororganer til transplantation.20-22 F.eks. er en total ekstern ørekonstruktion med autogen brusk – med det formål at genskabe et øre, der ligner den kontralaterale øremuskel i udseende – stadig et af de vanskeligste problemer inden for plastisk og rekonstruktiv kirurgi.23

Additive fremstillingsteknikker som 3D-printing tilbyder en potentiel løsning via evnen til hurtigt at skabe computerstøttede CAD-modeller (computer-aided design) ved at skære dem i lag og opbygge lagene opad ved hjælp af biologiske celler som blæk, i de præcise anatomiske geometrier af menneskelige organer.24-27 Variationer af 3D-printing er blevet anvendt som metoder til fremstilling af faste frie former, selv om brugen heraf primært har været begrænset til skabelse af passive mekaniske dele.24,28 Ekstruderingsbaseret 3D-printing er blevet anvendt til at konstruere hårdvævsskafter som knæmenisker og intervertebrale skiver komplet med indkapslede celler.29-31 Denne teknik giver mulighed for at skabe rumligt heterogene multimaterialestrukturer ved at anvende depositionsværktøjer, der kan ekstrudere en bred vifte af materialer.32 Endvidere muliggør funktionelle byggeblokke på nanoskala en alsidig bottom-up samling af komponenter på makroskala med indstillelige funktionaliteter. Dette kunne give mulighed for samtidig udskrivning af nanoelektroniske materialer og biologiske celler for at opnå tredimensionelt integrerede cyborgvæv og -organer med unikke egenskaber.33,34

Her introducerer vi en konceptuelt ny tilgang, der tager fat på ovennævnte udfordringer ved fuldt ud at sammenvæve funktionelle elektroniske komponenter med biologisk væv via 3D-udskrivning af nanoelektroniske materialer og levedygtige celleudsåede hydrogeler i de præcise anatomiske geometrier af menneskelige organer. Da elektroniske kredsløb er kernen i sanse- og informationsbehandlingsanordninger35 , giver in vitro-kulturering af den trykte hybridarkitektur mulighed for vækst af “cyborg-organer”, der udviser forbedrede funktionaliteter i forhold til den menneskelige biologi. Vores tilgang giver mulighed for at definere og skabe rumligt heterogene konstruktioner ved at ekstrudere en bred vifte af materialer i en lag-for-lag-proces, indtil den endelige stereolitografiske geometri er færdig. Dette koncept med 3D-printning af levende celler sammen med elektroniske komponenter og dyrkning af dem til funktionelle organer repræsenterer en ny retning i sammensmeltningen af elektronik og biologiske systemer. Sådanne cyborg-organer adskiller sig fra enten konstrueret væv eller konform planar/fleksibel elektronik og tilbyder en unik måde at opnå en tredimensionel sammensmeltning af elektronik og væv på.

Som et bevis på konceptet for denne tilgang har vi evalueret 3D-printingens evne til at skabe en levedygtig øreøre, som også indeholder elektronik, der muliggør alternative funktioner til den menneskelige hørelse. Menneskelige organer, der overvejende består af bruskvæv, som f.eks. øreøret, er egnede prototype-kandidater til at undersøge gennemførligheden af vores fremgangsmåde. Dette skyldes 1) den iboende kompleksitet i ørets anatomiske geometri, som gør det vanskeligt at bioteknisk konstruere det ved hjælp af traditionelle vævsteknologiske metoder, samt 2) enkelheden i dets struktur på bruskvævsniveau på grund af manglen på blodkar.23,36 Derudover giver bottom-up samling af nanoelektroniske matricer mulighed for hierarkisk at generere funktionelle elektroniske komponenter i makroskala. Specifikt demonstrerer vi 3D-printning af en chondrocytfrøet alginathydrogelmatrix med en elektrisk ledende sølvnanopartikel (AgNP) infunderet induktiv spoleantenne, der er forbundet med cochlea-formede elektroder understøttet på silikone. Tilsammen er resultatet en tredimensionel integration af funktionelle elektroniske komponenter i det menneskelige øres komplekse og præcise anatomiske geometri (fig. 1).

Der indgår følgende trin i processen. Først anvendes en CAD-tegning af det bioniske øre (fig. 1A) til at foreskrive den anatomiske geometri og den rumlige heterogenitet af de forskellige funktionelle materialer. Som beskrevet ovenfor omfatter tre materialer de tre funktionelle bestanddele (strukturelle, biologiske og elektroniske) i det bioniske øre. Disse materialer føres ind i en sprøjteekstruderingsbaseret Fab@Home 3D-printer (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (fig. 1B). Det printede bioelektroniske hybridørekonstrukt dyrkes derefter in vitro for at muliggøre vækst af bruskvæv for at danne et cyborgøre med evnen til at opfange elektromagnetiske signaler i radiofrekvensområdet (RF) ved hjælp af en induktiv spole, der fungerer som modtageantenne (figur 1C).

For at demonstrere vores tilgang printede vi det bioniske ørekonstrukt på følgende måde. Til stilladset pre-seedede vi en alginat-hydrogelmatrix med levedygtige chondrocytter ved en tæthed på ~60 millioner celler/mL (se understøttende oplysninger). Alginatmatrixen er tredimensionelt stabil i kultur, ikke-toksisk, kompatibel med pre-seeding og ekstrudering og er et egnet celletilførselsmiddel, fordi tværbinding kan initieres før deponering.37 Chondrocytterne, der blev anvendt til udskrivning, blev isoleret fra ledbrusk fra en måned gamle kalve (Astarte Biologics, Redmond, WA). En CAD-tegning af en menneskelig øreøre i stereolitografiformat (STL) med en integreret cirkulær spoleantenne forbundet med cochlea-formede elektroder blev brugt til at definere udskriftsbanerne ved at skære modellen i lag af kontur- og rasterfyldningsbaner. Krydsforbindelsen blev indledt i alginathydrogelmatrixen, der var forsået med levedygtige chondrocytter, som derefter blev 3D-printet sammen med ledende (AgNP-infusioneret) og ikke-ledende silikoneopløsninger (film 1). Sammen producerede denne metode de biologiske, elektroniske og strukturelle komponenter i det bioniske organ i en enkelt proces.

Figur 2A viser det 3D-printede bioniske øre umiddelbart efter printning. Det er bemærkelsesværdigt, at det viser sig at være en trofast gengivelse af CAD-tegningen i den præcise rumlighed for hvert materiale som dikteret af designet. Det udskrevne ørekonstrukt blev nedsænket i chondrocytkulturmedie indeholdende 10 % eller 20 % føtal bovin serum (FBS), som blev opdateret hver 1-2 dag (se understøttende oplysninger). Hybridøret viste god strukturel integritet og formfastholdelse under dyrkning (fig. 2B). Over tid blev konstruktionen gradvist mere uigennemsigtig; dette var mest tydeligt efter fire ugers dyrkning og er groft set i overensstemmelse med udviklingen af en ekstracellulær matrix (ECM). Den grove morfologi af det bioniske øre efter 10 ugers in vitro-kultur er vist i de understøttende oplysninger.

Viabiliteten blev testet umiddelbart før og under de forskellige faser af udskrivningsprocessen. Cellernes indledende levedygtighed blev bestemt efter dyrkning ved hjælp af en Trypan blue cell exclusion assay (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) og blev fundet at være 96,4 ± 1,7 % (Fig. 2C) (se understøttende oplysninger). Det trykte celleseedede alginatøre blev også testet med en LIVE/DEAD® Viability Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) og udviste en celleviabilitet på 91,3 ± 3,9 % med en homogen chondrocytfordeling. Dette resultat tyder på, at udskrivningsprocessen, herunder celleindkapsling og deponering, ikke har nogen mærkbar indvirkning på chondrocyt-levedygtigheden.

Denne fremgangsmåde med udskrivning af en forudsået hydrogelmatrix eliminerer især de store problemer, der er forbundet med begrænsninger i udsåningsdybden og uensartet udsåning i traditionelle metoder til udsåning af forudformede 3D-stilladser. Udsåning af chondrocytter i en bioabsorberbar alginatmatrix og formning af den via 3D-printning lokaliserer cellerne til en ønsket geometri, hvilket giver mulighed for ny ECM-produktion på definerede steder, når de dyrkes i næringsrige medier. Efterhånden som vævet udvikles, absorberes polymerstilladset igen (fig. 2D), således at det nye væv bevarer formen af den polymer, som cellerne blev udsået i. Den bionedbrydelige stillads giver hver enkelt celle bedre adgang til næringsstoffer og en mere effektiv fjernelse af affaldsstoffer.

Dernæst blev der foretaget en histologisk evaluering for at sammenligne morfologien af chondrocytterne i neocartilagen i det bioniske øre med morfologien i det oprindelige bruskvæv. Hæmatoxylin- og eosinfarvning (H&E) afslørede en ensartet fordeling af chondrocytterne i konstruktionerne (Fig. 2E) (se understøttende oplysninger). Histologi af ørevævet med Safranin O-farvning viste en relativt ensartet ophobning af proteoglykaner i det dyrkede ørevæv (Fig. 2F). Disse biokemiske data er i overensstemmelse med udviklingen af ny brusk.38 Endelig blev fluorescensmålinger anvendt til at fastslå levedygtigheden af det 3D-printede bioniske ørevæv efter 10 ugers in vitro vækstkultur ved hjælp af fluorescein diacetat (FDA) og propidiumjodid (PI) farvninger. Figur 2G og 2H viser henholdsvis det væv, der dækker spoleantennen, og det indre væv, der er i kontakt med elektroden, som løber vinkelret gennem vævet. I begge tilfælde udviste den dyrkede brusk en fremragende morfologi og levedygtighed på vævsniveau. Især kunne denne fremgangsmåde med dyrkning af væv i tilstedeværelse af abiotiske elektroniske materialer minimere immunresponset i det dyrkede væv.

Vi karakteriserede derefter bruskens mekaniske egenskaber på forskellige vækststadier, da ECM-udviklingen er stærkt korreleret med vævets mekaniske egenskaber under udvikling.39 Først blev der udført omfattende biokemiske og histologiske karakteriseringer. Prøver blev fjernet fra kulturer indeholdende 10 % og 20 % FBS efter 2, 4, 6, 8 og 10 uger og frosset ned for at måle DNA-indholdet i neokartilagen og for biokemisk evaluering af ECM (se støtteinformation). ECM-akkumulering i konstruktionerne blev evalueret ved at kvantificere mængden af to vigtige ECM-komponenter: 1) hydroxyprolin (HYP) som en markør for kollagenindholdet og 2) sulfateret glykosaminoglykan (GAG) som en markør for proteoglykaner. I uge 10 steg HYP-indholdet til 1,2 ± 0,1 μg/mg og 1,4 ± 0,2 μg/mg for kulturer, der indeholdt henholdsvis 10 % og 20 % FBS (Fig. 3A). De tilsvarende værdier for GAG-indholdet i uge 10 var 10,6 ± 0,6 μg/mg og 12,2 ± 1,0 μg/mg (fig. 3B). Denne stigning i GAG- og HYP-indholdet indikerer, at chondrocytterne er levende og metabolisk aktive i kulturen.

Næst blev trækegenskaberne analyseret ved at teste 3D-printede chondrocyt-alginat-hundeknogleprøver på forskellige punkter i kulturen, hvor hundeknoglerne indeholdt de samme celletætheder og identiske dyrkningsbetingelser som øret (se understøttende oplysninger). Vurdering af de mekaniske egenskaber viste, at hundeknoglernes Young-modul steg med tiden fra 14,16 kPa til 111,46 kPa i uge 10 (fig. 3C). Hundeknogler med en lavere chondrocyttæthed på 20 millioner celler/mL blev også testet under lignende betingelser for at forstå virkningen af den oprindelige chondrocyttæthed på de mekaniske egenskaber af det dyrkede væv. Det blev konstateret, at disse havde et lavere Young-modul på 73,26 kPa i uge 10. Dernæst blev hårdheden af det dyrkede bruskvæv i den 3D-printede aurikel karakteriseret ved hjælp af nanoindentationsmålinger. Indtrykkene blev udført på de forskellige anatomiske steder i auriklen (fig. 3D). Som det fremgår af tabel 1, viste det sig, at disse hårdhedsværdier var relativt ensartede og varierede fra 38,50 kPa til 46,80 kPa, hvilket bekræfter den strukturelle integritet af det trykte øre.40

For at demonstrere de forbedrede funktionaliteter i det 3D-printede bioniske øre udførte vi en række elektriske karakteriseringer. Først blev spoleantennens resistivitet målt ved hjælp af firepunktssonderingsmålinger og viste sig at være afhængig af den volumetriske strømningshastighed, der blev anvendt til udskrivning af den ledende AgNP-infunderede silikone (se understøttende oplysninger). Ved den optimale strømningshastighed blev resistiviteten af den trykte spole fundet at være 1,31 × 10-6 Ω-m, hvilket kun er to størrelsesordener højere end rent sølv (1,59 × 10-8 Ω-m). Dernæst udførte vi eksperimenter med trådløs radiofrekvensmodtagelse. For at demonstrere det bioniske øres evne til at modtage signaler ud over normale hørbare signalfrekvenser (hos mennesker 20 Hz til 20 kHz) dannede vi eksterne forbindelser til de cochlea-formede elektroder, der stammer fra det bioniske øres induktive spole (figur 4A). Øret blev derefter udsat for sinusbølger med frekvenser fra 1 MHz til 5 GHz. S21-parameteren (fremadrettet transmissionskoefficient) for spoleantennen blev analyseret ved hjælp af en netværksanalysator og viste sig at transmittere signaler i hele dette udvidede frekvensspektrum (figur 4B).

Mest vigtigt er det, at vi som et demonstrativt eksempel på alsidigheden i at ændre det endelige organ ved at ændre CAD-designet udskrev et supplerende venstre øre ved blot at afspejle den oprindelige model (se støtteoplysninger). Venstre og højre kanal af stereofonisk lyd blev eksponeret til det venstre og højre bioniske øre via transmitterende magnetiske sløjfeantenner med ferritkerner (Fig. 4C). Signalerne, der blev modtaget af de bioniske ører, blev indsamlet fra signaludgangen fra de dobbelte cochlea-formede elektroder og ført ind i et digitalt oscilloskop og afspillet af en højttaler til auditiv og visuel overvågning. Uddrag af de transmitterede og modtagne signaler af en varighed på 1 ms for både højre og venstre bioniske øre er vist i figur 4D og viser en fremragende gengivelse af lydsignalet. Det er bemærkelsesværdigt, at den afspillede musik (Beethovens “Für Elise”) fra det signal, som de bioniske ører modtog, havde en god lydkvalitet (film 2).

Sammenfattende blev der fremstillet designer-“cyborg-ører”, som er i stand til at modtage elektromagnetiske signaler i et omfattende frekvensområde fra Hz til GHz. Vores strategi repræsenterer et principbevis for sammenfletning af alsidigheden af additive fremstillingsteknikker med nanopartikelsamling og vævsteknologiske koncepter. Resultatet er generering af bona fide bioniske organer i både form og funktion, hvilket er valideret ved hjælp af vævsteknologiske benchmarks og elektriske målinger. Sådanne hybrider adskiller sig fra enten konstrueret væv eller planar/fleksibel elektronik og tilbyder en unik måde at opnå en problemfri integration af elektronik og væv på for at generere cyborg-organer “fra hylden”. Endelig kan brugen af 3D-printning med andre klasser af nanoskala funktionelle byggesten, herunder halvleder-, magnetiske, plasmoniske og ferroelektriske nanopartikler, udvide mulighederne for at konstruere bioniske væv og organer.