Induktion af peptidbindingsdipoler driver kooperativ helixdannelse i (AAQAA)3-peptidet | CDhistory

Resultater og diskussion

Helixindholdet fra HREMD-simuleringerne som en funktion af temperaturen er afbildet i Fig. 1 for både Drude-2013- og C36-kraftfelterne sammen med de eksperimentelle NMR-data (27) og de tidligere rapporterede resultater for C36 opnået fra temperaturreplikatudvekslingssimuleringer (11). NMR-værdierne er baseret på målinger af carbonyl-kemisk forskydning ved syv temperaturer fra 269 til 363 K foretaget af Shalongo og Stellwagen, og de er beregnet ved hjælp af tabel 1 og Eq. 2 i reference (27). Fraktionshelix for de enkelte systemer som en funktion af tiden er vist i Fig. S1. Ved 300 K forudsiger Drude-simuleringen et helixindhold på 25 %, hvilket er en smule højere end estimater på 19 % og 22 % fra henholdsvis NMR- og cirkulær dichroismemålinger (26). Ved 280 K er det spiralformede indhold (34 %) mindre end det, der er opnået fra NMR-eksperimenter (40 %), mens afvigelsen ved den højere temperatur (340 K) er lille (4 % mod 3 %). Kvalitativt forudsiger det Drude-polariserbare kraftfelt en vis mængde helix ved 300 K og næsten ingen helix ved den højere temperatur på 340 K, mens de fleste additive kraftfelter fører til enten helixdannelse ved begge temperaturer eller ingen helix ved begge temperaturer (9-11). Vi bemærker, at det er en udfordring at opnå fuld konvergens af peptidprøvetagningen, som er nødvendig for at beregne helixindholdet, og vi erkender, at vores resultater ikke er fuldt konvergerede; men overensstemmelsen mellem de nuværende C36- og tidligere offentliggjorte temperaturreplikaudvekslingsresultater for helixindholdet indikerer, at HREMD-tilgangen har givet resultater, der har været repræsentative for det eksperimentelle regime.

Konsistensen med eksperimentelle data er også til stede på en basis pr. residue, som vist i fig. 2. For eksempel er Drude-simuleringerne, der viser, at den C-terminale alaninrest altid er i den oprullede tilstand, i overensstemmelse med de eksperimentelle NMR-målinger af kemisk forskydning (27). N-terminus’ spiraltilbøjelighed er højere end C-terminus’ på grund af tilstedeværelsen af acetylgruppen, som kan danne en i til i + 4 hydrogenbinding, der stabiliserer spiralen, som det ses i både simulerings- og NMR-data. Denne korrekte behandling af sekvensafhængighed viser yderligere Drude-modellens kvalitet i behandlingen af coil-helix-ligevægten. Med C36 er den ekstra helikale tilbøjelighed ved N-terminus ikke til stede, selv om den blev observeret i den tidligere undersøgelse (32).

Den efterfølgende analyse omfattede fordelingen af helixernes længder under simuleringerne. Fig. 3 viser sandsynlighederne for at observere n på hinanden følgende rester i α-regionen. Ved 340 K, selv om Drude-modellen kun forudsiger 4,2 % brøkdel helix, er lange helixsegmenter til stede, idet sandsynligheden for at observere helixer med en længde på ni rester (1,1 %) er højere end sandsynligheden for en helix med syv rester. En sådan sandsynlighedsfordeling er mere fremtrædende ved 300 K, med et maksimum ved 12 rester, hvilket svarer til den gennemsnitlige helixlængde i proteiner (45). Ved 280 K er maksimum i helikserne lidt kortere end ved 300 K, selv om foldningens kooperative karakter stadig er tydelig i betragtning af den fremtrædende betydning af helikser på 8 til 10 rester i forhold til kortere helikser. I de additive simuleringer observeres der ikke ved nogen temperatur fordelinger med højere sampling for længere helikser, idet korte helikser er de mest befolkede. Der er dog visse tegn på kooperativitet ved 280 og 300 K, som det fremgår af tilstedeværelsen af små toppe i fordelingerne ved n = 10. Disse resultater indikerer, at Drude-modellen har en betydelig større foldningskooperativitet end den additive C36-model.

Det skal også understreges, at den samlede gennemsnitlige fraktion helix er lig med summen af sandsynlighederne (som præsenteret i fig. 3) ganget med de respektive helixlængder, således at længere helixer yder et langt større bidrag til det rapporterede helixindhold i den polariserbare model. For Drude-modellen ved 300 K tegner helikale segmenter med en længde på 10 rester eller mere sig for eksempel for 78 % af den observerede helix, mens disse lange helikaler kun bidrager med 25 % med C36-kraftfeltet. Disse resultater understøtter yderligere en situation med det polariserbare kraftfelt, hvor når først en helix er dannet, har den større tendens til at strække sig, hvilket giver den mere udprægede stigning i udtagningen af lange helixer vist i Fig. 3.

Men selv om Drude-modellen har en større tilbøjelighed til at danne helikale tilstande sammenlignet med den additive model, favoriserer den også mere forlængede udfoldede tilstande. Dette fremgår af, at den gennemsnitlige gyrationsradius for (AAQAA)3 for oprullede tilstande (dvs. dem, der ikke indeholder nogen α-helix) er 10,9 Å og 10,0 Å for henholdsvis Drude- og C36-simuleringerne ved 300 K. Dette hænger sammen med, at Drude-modellen giver en mere udtalt bimodal fordeling af gyrationsradius sammenlignet med C36-modellen, som vist i fig. S4. Disse resultater indikerer yderligere kooperativiteten af helixdannelse i det polariserbare Drude-kraftfelt.

For at forstå den stærke foldningskooperativitet med Drude-polariserbart kraftfelt på mikroskopisk niveau analyserede vi rygsøjlens ϕ, ψ-fordelinger for de helikale rester, da denne prøveudtagning blev brugt til at forklare den forbedrede temperaturafhængighed, som C36’s CMAP-potentiale medførte sammenlignet med andre additive kraftfelter (11,32). Den gennemsnitlige population af rester i den brede αR-region, α+ (se fig. S2), i den mere strenge α-region og i helikale segmenter (%α-helix), som defineret ved tre på hinanden følgende helikale rester, er anført i tabel 1 for 300 K-simuleringerne. Selv om det polariserbare kraftfelt giver den højeste fraktion helix baseret på både %α og %α-helix, har det den laveste population af rester i den brede α+-region. Følgelig er forholdet mellem α/α+- og α-helix/α-populationerne højere i Drude- end i C36-simuleringen, hvilket indikerer, at når en rest først er i α+-regionen, har den en større sandsynlighed for at udtage prøver fra den mere strenge, helixdannende α-region. Når en rest først er i α-regionen, har den desuden større sandsynlighed for at deltage i en strækning af tre eller flere på hinanden følgende rester i α-regionen, dvs. at den danner en spiralformet struktur. Dette tyder på et stejlt tragtlignende energilandskab. Lignende tendenser observeres ved både lavere og højere temperatur, som vist i tabel S1.

Udstrækningen af kooperativitet med det additive C36-kraftfelt blev tilskrevet mange-kroppeeffekter i forbindelse med CMAP-potentialet, der gør det muligt at parametrisere kooperativiteten af ϕ- og ψ-dihedralerne eksplicit i modellen. For resterne i de helikale segmenter resulterer simuleringer med C36 i et meget smallere frit energibassin i deres ϕ, ψ-fordelinger (Fig. 4). Dette snævre helikale minimum er relateret til den empiriske justering af CMAP-terminen direkte rettet mod en PDB-fordeling (29) med efterfølgende optimering af CMAP, der giver C36, baseret på forskydning af overordnede regioner af CMAP for at forbedre den samlede fraktion helix af (AAQAA)3 (11). At pålægge en sådan specifik optimering i prøveudtagningen af ϕ, ψ-faserummet kan være en nødvendighed for additive kraftfelter, mens dette ikke er nødvendigt i Drude-kraftfeltet, hvilket fremgår af den bredere ϕ, ψ-fordeling (Fig. 4), fordi de yderligere, elektroniske frihedsgrader, der er inkorporeret i den polariserbare model, giver den observerede kooperativitet.

Verifikation af bidraget fra den elektrostatiske polariserbarhed til kooperativitet involverede analyse af peptidryggenes dipolmomenter, beregnet som ensemblegennemsnit fra simuleringerne for de forskellige konformationelle områder. Resultaterne i tabel 2, i de rækker, der er mærket “Total”, viser, at den polariserbare Drude-model fører til meget større dipolmomenter end den additive C36-model, som tidligere observeret i MD-simuleringer af proteiner og andre peptidsystemer, idet de forlængede konformationer har større dipoler end de spiralformede konformationer i den polariserbare model (33). For at illustrere, hvordan miljøet påvirker dipolerne, blev der opnået intrinsiske dipoler for alanintripeptidet i gasfasen som beskrevet i de understøttende oplysninger. Disse værdier er rapporteret i tabel 2 som “Intrinsic”, idet forskellen mellem de samlede og intrinsic dipoler giver “Enhancement” af peptiddipolerne på grund af det fulde miljø bestående af resten af peptidet og det omgivende opløsningsmiddel. Som det fremgår, forstærkes peptidgruppernes dipolmomenter betydeligt med Drude-2013, mens der for det additive kraftfelt, som forventet, ikke er nogen signifikant forskel mellem kondenserede og gasfaser. Den svage forøgelse af peptiddipolerne, der er observeret i C36-simuleringerne (∼ 0,03 D), er forbundet med forlængelsen af peptidets C = O-bindinger på grund af hydrogenbindingsinteraktioner. I Drude-simuleringerne er den forbedrede dipol større for de rester i α-konformationen (∼ 1,0 D) end uden for dette område (∼ 0,6 D). For at adskille opløsningsmidlets induktionseffekter fra intrapeptidinteraktioner beregnede vi de gennemsnitlige dipolmomenter efter at have fjernet alle vandmolekyler fra MD-trajektorierne og derefter afslappet Drude-partiklerne, hvilket giver værdierne for “intramolekylær forstærkning”. Sammenligning af disse med de samlede forstærkningsværdier viser en signifikant forskel i den intrapeptidiske forstærkning, når en rest besætter coiled-tilstande (∼ 0,25 D) i forhold til “α (ikke i α-helix)”-tilstande (0,52 D) i forhold til α-helix-tilstande (0,76 D). Hvis vi antager, at induktionen fra tilstødende rester (i – 1 og i + 1) bidrager med en forstærkning på 0,39 D, baseret på “α+ (ikke i α)”-værdien, så kan de resterende 0,37 D for helikale rester tilskrives hydrogenbindingen mellem i- og i+4-resterne, som er det unikke træk ved helikal struktur. Interessant nok viser kvantekemiske beregninger af modelsystemer, at elektrondensitetsomfordeling tegner sig for halvdelen af helixdannelseskooperativiteten (46), og den kooperative stabiliserende effekt inden for en helix på grund af de intrahelikale hydrogenbindinger er stærkere end den mellem helixen og vand, der er forbundet med hydrogenbindinger mellem carbonylgrupperne og vand (47), hvilket stemmer overens med den foreliggende observation.

Resultaterne af replikudvekslingssimuleringen kan diskuteres i forbindelse med helix-spole-teorien ved hjælp af Lifson-Roig-modellen. Efter den protokol, der er skitseret af Best og Hummer (9), blev Lifson-Roig w, v-parametrene beregnet for både Drude- og C36-simuleringerne. De resulterende værdier er anført i tabel 3 sammen med de eksperimentelle værdier, der er bestemt af Rohl og Baldwin (25,26). Den temperaturuafhængige parameter v beskriver tilbøjeligheden til spiralkernedannelse, og simuleringerne resulterer i værdier på 0,11 og 0,17 for henholdsvis Drude- og C36-kraftfelterne sammenlignet med den eksperimentelle vurdering på 0,04. Forskellene tyder på, at i MD-simuleringerne konverterer resterne for let fra en spolekonformation til en α-konformation, selv om resultaterne med Drude-modellen er bedre end med den additive model. Overvurderingen af v-parameteren i simuleringerne kompenseres af deres undervurdering af w-parameteren, som beskriver helixudvidelsen, for at opnå en lignende brøkdel helix, som observeret i eksperimenterne. Drude-modellens w-parameter er større end C36-modellens ved 280 og 300 K, hvilket er i bedre overensstemmelse med de eksperimentelle data. Værdierne ved 340 K er imidlertid mindre end værdierne for C36 og stemmer dårligere overens med eksperimentet. Drude-modellen er således i bedre overensstemmelse for de fleste af de analyserede Lifson-Roig-termer, hvilket stemmer overens med den forbedrede kooperativitet i modellen.