Det okulære respons på en intrakameral injektion
Det er blevet foreslået, at de F4/80+ monocytiske celler, der er centrale for induktionen af ACAID, var residente iris- og ciliarkropsceller, der emigrerede fra iris via Schlemm’s kanal1,6,10 til cirkulationen. Da antigenet er til stede i øjet i mindst 24 timer, kan antigenet have en “depot”-virkning, selv om noget af antigenet er i cirkulationen hurtigt efter den intrakamerale injektion af antigenet8 . Da den intrakameratale injektion af antigen inducerer fremkomsten af ACAID-inducerende PBMC, er det sandsynligt, at disse monocytære celler snarere end cirkulerende antigen alene inducerer ACAID.
En intravitreal injektion af antigen inducerer en infiltration af monocytære celler til nethinden som et tidligt stadium af uveitis.11,12 Desuden inducerer okulær infektion et stærkt inflammatorisk infiltrat i det bageste eller forreste kammer.12-14 I overensstemmelse med en sådan inflammation er der en stigning i inflammatoriske cytokiner i okulære væsker som f.eks. kammervæske. Følgelig inducerer en intrakameral injektion af partikulært antigen en stigning i mRNA for TNF-α, hvilket tyder på et tidligt inflammatorisk respons i det forreste kammer.14,15 Desuden induceres den systemiske undertrykkelse af forsinket type overfølsomhed ikke hos mus, der får en intrakameral injektion af antistoffer mod TNF-α sammen med antigen, hvilket tyder på, at TNF-α er påkrævet under induktion af ACAID. Desuden var induktionen af ACAID i disse undersøgelser afhængig af størrelsen af den nål, der blev anvendt til den intrakameratale injektion af opløselige proteiner, og om antigenet var i partikulær eller opløselig form.15 Disse forfattere foreslog, at den intrakameratale injektion af partikulære antigener og/eller størrelsen af den nål, der anvendes til intrakameratale injektioner, inducerer et traume, der er nødvendigt for at inducere ACAID. Makrofager og dendriforme celler, der udtrykker den dendritiske cellemarkør CD11c, er residenter i iris, ciliærlegeme og choroid i det forreste segment.8,10,16,17 Antigener, der injiceres i det forreste kammer, optages hurtigt af disse celler. Desuden findes makrofager og dendriforme celler i nærheden af Schlemm’s kanal17,18 , som menes at være stedet, hvor F4/80+ celler fra det forreste kammer udgår til kredsløbet.1 Der er imidlertid blevet sat spørgsmålstegn ved, om de residente irisceller, der optager antigen, udgår til kredsløbet.16 Opløseligt antigen forlader hurtigt forkammeret via kredsløbet og fordeler sig på samme måde som intravenøst antigen.8 Noget af det antigen, der forlader øjet, kan være i en tolerogen form.19 Det er dog sandsynligt, at det intrakammerale antigen præsenteres i thymus og milt af såkaldte “tolerogene antigenpræsenterende celler”, der forlod øjet med antigenet. Desuden inducerer TGF-β i kammervandet eller produceret af F4/80+ celler i iris F4/80+ celler en suppressiv fænotype i perifere F4/80+ celler10,20,21 , hvilket tyder på, at induktionen af en suppressiv fænotype i F4/80+ celler sker i forkammeret.
I lighed med behandlingen af perifere F4/80+ celler med kammervæske og antigen, pålægger inkubation af F4/80+ peritoneale exudatceller med antigen og TGF-β in vitro cellerne en suppressiv fænotype. Når disse celler injiceres iv i naive mus, inducerer de antigenspecifikke spleniske regulatoriske T-celler svarende til den, der opnås ved intrakamerat injektion af antigen.21 ACAID induceres af meget få F4/80+ celler, der behandles på denne måde1 , hvilket tyder på, at (ikke påviselige) celler, der emigrerer fra iris og ciliærlegeme, kan inducere ACAID. Desuden inducerer F4/80+ irisceller fra mus, der har modtaget en intrakameral injektion af antigen, induktion af ACAID eller giver F4/80+ PBMC en suppressiv fænotype svarende til de cirkulerende celler, der er genvundet fra mus, der har modtaget en intrakameral injektion af antigen9,21 . Det er sandsynligt, at antigen, der optages og behandles af irisens antigenpræsenterende celler, kan overføres til de PBMC, der infiltrerede det forreste kammer, på samme måde som antigen overføres til ACAID-inducerende B-celler i milten af TGF-β-behandlede, antigenbærende peritoneale exudatceller22 . Tilsammen tyder disse observationer på, at begivenheder, der finder sted i forkammeret, kan inducere en suppressiv fænotype på ikke-residente inflammatoriske celler, der infiltrerede forkammeret.
Baseret på ovenstående betragtninger undersøgte vi muligheden for, at den intrakameratale injektion af antigen inducerer en tilstrømning af cirkulerende PBMC til forkammeret som følge af injektionstraumaet. Disse infiltrerede celler ville blive udsat for immunosuppressiv TGF-β i kammervæske og residente iris/ciliærlegeme dendriforme celler, der kunne præsentere det injicerede antigen for de infiltrerede PBMC. I overensstemmelse med denne hypotese vil de celler, der blev rekrutteret til det forreste kammer på grund af den skade, som injektionen forårsagede, derefter recirkulere og vende hjem til thymus og milt, hvor de inducerer regulatoriske T-celler.
I løbet af 3 timer efter den intrakamerale injektion af ovalbumin (OVA) fandt vi også en stigning af TNF-α i kammervandet som beskrevet af Ferguson et al.15 Derudover har vi observeret en stigning i kemokinen MCP-1 i kammervandshumor seks timer efter den intrakamerale injektion (Fig. 1). Et nålestik uden injektion af PBS inducerede forekomsten af TNF-α i kammervandshumor, og injektion af PBS øgede kun mængden af TNF-α fem gange mere end den mængde, der blev opnået ved et nålestik. TNF-α i vandhumor falder hurtigt og kan ikke påvises 12 timer efter intrakameral injektion af ovalbumin (OVA) (data ikke vist). MCP-1 bibeholdes i vandig humor i en længere periode. I modsætning til TNF-α nås MCP-1-topniveauet i kammervandshumor dog efter 12 timer og forbliver indtil 16 timer efter den intrakameratale injektion af OVA (data ikke vist). Denne stigning i TNF-α- og MCP-1-niveauerne i kammervandshumor efter den intrakameratale injektion af antigen tyder på, at der indledes et inflammatorisk respons i det forreste kammer. Desuden øges TNF-α ikke i kammervandshumor, og der induceres heller ikke ACAID, hvis den nål, der anvendes til den intrakameratale injektion, er for lille, og/eller hvis antigenet ikke er inflammatorisk.15
Den intrakameratale injektion af antigen forhøjer TNF-a og MCP-1 i kammervandshumor. Tre-6 timer efter, at 6-8 uger gamle naive BALB/c-hunmus havde modtaget iv 5 × 106 – 1 × 107 CFSE-mærkede PBMC, blev musene bedøvet med en ip-injektion af ketamin/xylazin7 og fik en intrakameral injektion af PBS, PBS + 50 μg OVA eller et nålestik alene med en 24 g-nål. Seks timer efter, at naive mus havde modtaget en intrakameral injektion, blev vandigt humør opsamlet fra de euthaniserede mus, og 10 μl blev analyseret ved ELISA for TNF-α og MCP-1. Data repræsenterer det gennemsnitlige +/- S.E.M. pg påvist fra 4-6 gentagelser/gruppe i 2-3 forsøg.
For at bestemme, om der er en samtidig tilstrømning af inflammatoriske celler til det forreste kammer efter den intrakamerale injektion af antigen, fik mus, der blev injiceret iv med PBMC mærket med det fluorescerende farvestof CFSE, også en intrakameral injektion. Ved hjælp af denne fremgangsmåde observerede vi en betydelig tilstrømning af CFSE-mærkede og umærkede (værts) F4/80+ monocytære celler, der udtrykker kemokinreceptorerne CCR2 og CCR5, som det fremgår af en genvinding af disse celler fra musenes irider 24 timer efter, at musene havde modtaget en intrakameral injektion af antigen. Der var ingen stigning i disse celler i kontroller, der modtog iv CFSE-mærkede PBMC, men som ikke fik en intrakameral injektion af antigen.23 Ca. 48 timer efter den intrakamerale injektion af antigen falder antallet af infiltrerede celler ved iris og stiger i thymus og milt (fig. 2). Denne stigning i cirkulerende monocytære celler ved iris skyldes sandsynligvis en infiltration af cirkulerende monocytter som reaktion på traumet fra den intrakamerale injektion +/- irritationsmidlet PBS og/eller antigen/PBS, fordi antallet af infiltrerede monocytære celler steg, når musene fik intrakameralt antigen: infiltration af CFSE-mærkede PBMC induceret af kun injektion var <injektion af PBS < injektion af TNP-BSA/PBS. Monocytiske celler, der rekrutteres til iris efter intrakameral injektion af antigen, udtrykker både CCR2 og CCR5.23 Cellernes migration til iris kræver ekspression af CCR2, men ikke af CCR5, fordi CCR2 -/- PBMC ikke kommer til iris, men CCR5 -/- PBMC kommer til iris efter intrakameral injektion af antigen. Desuden inducerer intrakameral injektion af OVA til CCR2 -/- mus ikke cirkulerende monocytiske celler, der overfører undertrykkelsen af forsinket type overfølsomhed (DTH) over for OVA, når de injiceres iv til wildtype-modtagere.23
Migration af PBMC efter intrakameral injektion. Bedøvede7 BALB/c-mus fik en intrakameral injektion af trinitrophenyleret bovin albumin seks timer efter, at musene havde modtaget iv 5 × 106 -1 × 107 CFSE-mærkede PBMC. Fireogtyve timer efter den intrakamerale injektion blev musene euthaniseret ved CO2-inhalation, og irider, milt og thymi blev fjernet, samlet og enkeltcelle-suspensioner fremstillet. Cellerne blev derefter mærket med phycocyanin-anti-F4/80 og analyseret ved flowcytometri. Den procentvise stigning i CFSE, F480+ celler blev beregnet ved: