En vigtig posttranslationel modifikation af histoner er acetylering af ɛ-aminogrupper på konserverede lysinrester, der findes i de amino-terminale haler af disse proteiner. Acetylering neutraliserer de positivt ladede lysiner og påvirker derfor histonernes interaktioner med andre proteiner og/eller med DNA. Histonacetylering har længe været forbundet med transkriptionelt aktivt kromatin og er også impliceret i histonaflejring under DNA-replikation (1, 2). Den første kloning af et histonacetyltransferase (HAT)-gen, nemlig HAT1-genet fra gær, blev rapporteret i 1995 (3). Efterfølgende blev det antydet, at HAT1-proteinet er cytoplasmatisk og involveret i histonaflejring (4), selv om manglen på fænotyper af gær hat1 mutanter, samt nylige beviser for, at både de menneskelige og gær enzymer er nukleære (ref. 5; S. Tafrov og R.S., upubliceret arbejde), gør HAT1’s in vivo funktion uklar.
Et stort gennembrud på dette område var oprensningen og kloningen af HAT A, en HAT fra makronukleus af ciliaten Tetrahymena (6). Sekvensen af HAT A viste, at den lignede en kendt transkriptionel koaktivator fra gær, GCN5. Siden da har talrige undersøgelser vist, at GCN5 (og den beslægtede P/CAF) er konserverede HAT’er, hvis aktivitet på nukleosomer letter initieringen af transkription (gennemgået i ref. 7). Det er interessant, at GCN5 i sig selv kan acetyle frie histoner (især Lys-14 af H3), men ikke nukleosomer. Acetylering af nukleosomer af GCN5 kræver, at den befinder sig i et af to store proteinkomplekser kaldet Ada og SAGA i gær (8). Inden for de sidste par år er flere pattedyrproteiner, der ikke er beslægtet med GCN5, men som også er involveret i transkriptionel aktivering, blevet vist at have HAT-aktivitet. Disse omfatter CBP/p300, TAF250, ACTR og SRC-1 (9-12). Det er således ved at blive klart, at histonacetylering af nukleosomer er en væsentlig komponent i den flertrins genaktiveringsproces.
I dette nummer af Proceedings rapporterer Trievel et al. (13) om krystalstrukturen af det katalytiske HAT-domæne af GCN5 fra gær. Dette domæne omfatter resterne 99-262 af det 439-aa store protein. En del af deres struktur, der består af fire antiparallelle β-strenge (β1-4), efterfulgt af en α-helix (α3) og endnu en β-streng (β5), er vist i Fig. Fig.1.1. Denne del af GCN5 ligner i sin struktur meget gær HAT1 (14) samt to andre N-acetyltransferaser, hvis substrater ikke er histoner, nemlig aminoglycosid 3-N-acetyltransferase (AAT; ref. 15) og serotonin N-acetyltransferase (16). Alle disse enzymer er medlemmer af en familie af proteiner, der ved sekvensanalyse er identificeret som proteiner med lighed med kendte N-acetyltransferaser som GCN5, og som derfor kaldes GNAT-superfamilien (17). Medlemmerne af denne superfamilie har det til fælles, at de overfører en acetylgruppe fra acetyl-CoA til en primær aminogruppe, om end der er tale om meget forskellige aminogrupper for de forskellige enzymer; dvs, på ɛ-aminogrupper på lysiner i tilfælde af HAT’er, på α-aminogrupper på N-terminalerne af proteiner i tilfælde af enzymer som ARD1 eller MAK3, på sukkerstoffer i tilfælde af AAT (15) og GNA1 (18, 19) eller på serotonin for serotonin-N- acetyltransferase (16). Alle medlemmer af GNAT-superfamilien har et bevaret motiv kaldet motiv A (vist med rødt i fig. Fig. Fig.1),1), og de fleste af dem har to andre bevarede motiver kaldet B og D.
Ribbydiagram af GCN5, der viser den bevarede kerne, der findes i fire N-acetyltransferaser og i en N-myristoyltransferase. Motiv A i GNAT-superfamilien er vist med rødt. Acetyl CoA, som findes i HAT1, er modelleret ind i GCN5-strukturen. Svovlen i acetyl CoA er vist med gult.
Det blev forudsagt, at de konserverede motiver i GNAT-superfamilien ville være involveret i bindingen af acetyl CoA, fordi det er det eneste substrat, som disse forskellige N-acetyltransferaser har til fælles (17). Faktisk bekræftede strukturen af HAT1 med bundet acetyl-CoA, at motiv A er involveret i CoA-binding (14), ligesom det strukturelle arbejde med aminoglycosid 3-N-acetyltransferase (15) og serotonin-N-acetyltransferase (20) har bekræftet, at motiv A er involveret i CoA-binding. I fig. fig. 11 er acetyl CoA blevet modelleret ind i GCN5-strukturen, baseret på dets placering i HAT1 (13, 14). Acetyl CoA er bundet i en V-formet kløft, der er dannet mellem β-strenge 4 og 5. Det meget bevarede motiv A i GNAT-familien binder sig til pyrofosfatdelen af acetyl-CoA. Pantothenat- og β-mercaptoethanolamin-enhederne i CoA er orienteret langs β4 og hydrogenbundet til denne, hvorved de efterligner en β-streng.
Trievel et al. (13) foreslår en mekanisme for katalysen af GCN5. De foreslår, at en glutamatrest (Glu-173) er placeret til at abstrahere en proton fra en NH3+ gruppe på den lysin, der skal acetyleres, således at den uladede aminogruppe derefter kan udføre et nukleofilt angreb på carbonylkulstoffet i den reaktive thioestergruppe i acetyl CoA. Fig. Fig.22 viser en superposition af de formodede aktive områder af GCN5 (i gul farve) og HAT1 (i rød farve) med bundet acetyl CoA. Igen bemærkes det, hvor strukturelt ens de to proteiner er i denne region. Ifølge Trievel et al.’s forslag ville Glu-173 i GCN5, især efter reorientering af dets sidekæde, være tæt nok på den indkommende lysin til at udføre basekatalyse. Mutation af Glu-173 til Gln afskaffer faktisk aktiviteten in vivo og in vitro (13). Der er ingen Glu- eller Asp-rest på den tilsvarende position i HAT1. Vi bemærker dog, at Glu-255 eller Asp-256 i HAT1 på den tilstødende β-streng af spalten er placeret således, at de kunne udføre den samme katalytiske funktion (Fig. (Fig.2).2). Disse rester er endnu ikke blevet muteret.
Superposition af β4-α3-β5 af GCN5 (gul) og det tilsvarende område af HAT1 (rød). Proteinerne er repræsenteret som Cα-spor med bundet acetyl-CoA. Glu-173 af GCN5, som menes at være involveret i katalysen, er vist i kugle- og pindrepræsentation, ligesom resterne Glu-255 og Asp-256 af HAT1.
Det fremgår tydeligt af strukturerne af GCN5, HAT1 og to andre medlemmer af GNAT-superfamilien, at de deler en konserveret kerne, herunder bindingsstedet for acetyl CoA (Fig. (Fig.1).1). Interessant nok har N-myristoyltransferase en lignende struktur som de N-acetyltransferaser, der er diskuteret ovenfor (21, 22), selv om dette enzym overfører en meget større acylgruppe fra myristoyl CoA til α-aminogrupper af glyciner ved N-terminalerne af substratproteiner. På den anden side har chloramphenicol acetyltransferase, som acetylerer en hydroxylgruppe, ikke en lignende struktur. Det ser ud til, at GNAT-enzymerne, der acetylerer aminogrupper på en række forskellige substrater, alle binder acetyl-CoA på en meget lignende måde og måske deler en lignende katalytisk mekanisme. Naturligvis vil disse enzymer være forskellige i de regioner, der binder det substrat, der skal acetyleres. For så vidt angår HAT’er vil det næste mål være at bestemme en struktur med et histon- eller peptid-substrat bundet til enzymet.