Strukturelle implikationer
Resultatet af at modificere det cysteinholdige mutantprotein (K41C) med bromoethylamin er et enzym, der er ret tæt beslægtet med RNase A af vild type. Alligevel er kcat/Km-værdien for katalyse af K41S-ethylaminocystein RNase A kun 8 % af den værdi, der gælder for enzymet af vild type. Forskellen mellem de to proteiner må ligge i forskellen mellem en thioethergruppe og en methylengruppe. Selv om vinklerne for C-S-C-bindinger har tendens til at være mere spidse end for C-CH2-C-bindinger, opvejes denne forskel af den større længde af C-S-bindinger.3g,14 Molekylær modellering viser, at de primære amingrupper i S-ethylaminocystein og lysin kan overlejres med en nøjagtighed på 0,1 Å. En mere signifikant forskel mellem S-ethylaminocystein og lysin er deres relative præference for gauche- frem for anti-torsionsvinkler.15 Anti-konformationen af CC-CC-bindinger er begunstiget med ca. 0,8 kcal/mol i modelforbindelser.16 Faktisk er den gennemsnitlige K41-torsionsvinkel (175 ± 3)° i RNase A’s kompleks med cyklisk 2′,3′-uridinvanadat (U>v), en formodet overgangstilstandsanalog (figur 2). I modsætning til CC-CC-bindinger er gauche-konformationen af CS-CC-bindinger begunstiget med 0,05-0,20 kcal/mol.17 Molekylær modellering viser, at CS-CC-bindingen af en S-ethylaminocysteinrest i position 41 kan være i gauche-konformationen uden at forstyrre strukturen af det native protein. Således er thioethersidekæderne ved position 41 sandsynligvis mindre stive og forlængede end alkylsidekæderne. Vi formoder derfor, at katalysen af S-ethylaminocysteinenzymet ikke er lige så effektiv som katalysen af RNase A af vild type på grund af de entropiske omkostninger ved at fiksere en thioether i all anti-konformationen.
Struktur af det aktive sted for RNase A bundet til uridin 2′,3′-cyklisk vanadat. Strukturen blev raffineret ved 2,0 Å ud fra røntgen- og neutron diffraktionsdata indsamlet fra krystaller dyrket ved pH 5,3. Sidekæden af phenylalanin 120 og uracilbasen er ikke vist.
Den katalytiske effektivitet afhænger af længden af sidekæden af rest 41. RNase A-varianter, der har en aminogruppe i slutningen af en sidekæde, der er længere end lysinets, er mere aktive katalysatorer end umodificeret K41C RNase A. Dermed tolereres yderligere længde i det aktive sted. Dog er enzymer, hvor en aminogruppe i position 41 er adskilt fra hovedkæden med 4 atomer, mere aktive end enzymer, hvor den er adskilt med 5 atomer. Dette resultat kan skyldes den ekstra konformationsentropi eller ugunstige torsionsvinkler for længere sidekæder.
Der opnås ikke nogen væsentlig fordel, hvis rest 41 kan donere en anden hydrogenbinding. Guanidino- og acetamidinogrupper har potentiale til at interagere samtidigt med mere end ét oxygen i en fosforylgruppe. F.eks. bruges en guanidinogruppe til at binde fosforylgrupper af HIV-1 Tat-proteinet18 og af kunstige receptorer.19 Endvidere synes et arginin i Staphylococcal nuclease og ribonukleaser af T1-familien at spille rollen som K41 i RNase A.20 Vi har erstattet K41 med en argininrest og en S-acetamidinorest, som er en kort analog af arginin. Værdierne af ΔΔG‡ for disse enzymer er mindre end værdierne for de analoge enzymer med kun en primær aminogruppe i sidekæden i position 41. Det ser således ud til, at en hydrogenbinding er nok til at opnå en effektiv katalyse. Dette resultat er i overensstemmelse med det krystallinske kompleks af RNase A med U>v (figur 2). Vanadylgruppen i U>v er en tilnærmelsesvis trigonal bipyramide med to ikke-brydende ækvatoriale oxygener, O1V og O3V. Oxygen O1V accepterer en hydrogenbinding fra sidekæden af glutamin 11, mens O3V accepterer en hydrogenbinding fra hovedkæden af phenylalanin 120. Kun O1V er i stand til at acceptere en hydrogenbinding fra K41.
Mekanistiske implikationer. Den katalytiske rolle, der oftest tilskrives K41, er at stabilisere den overskydende negative ladning, der opbygges på de ikke-brydende fosforyloxygener under RNA-spaltning (figur 2). Opbygning af ladning kan ske i en pentakoordineret overgangstilstand (eller fosforanintermediat), når 2′-hydroxylgruppen angriber fosforen på vej til at fortrænge 5′-nukleosidet. Det er blevet antaget, at denne stabilisering sker ved hjælp af coulombiske interaktioner.12c,21 Men for nylig er det også blevet foreslået, at stabiliseringen sker ved hjælp af en kort, stærk hydrogenbinding, der involverer den delvise overførsel af en proton fra K41.22
De fremtrædende træk ved en lysinrest er dens positive ladning og dens evne til at donere hydrogenbindinger. Tre af de 5 semisyntetiske enzymer samt K41R har disse egenskaber til fælles. Det er ikke let at skelne mellem en vekselvirkning, der udelukkende er baseret på coulombiske kræfter, og en vekselvirkning, der er baseret på hydrogenbindinger mellem to ladede arter. Det følgende er den enkleste forklaring, der er i overensstemmelse med dataene i tabel 1.
Skellet mellem hydrogenbindinger og coulombiske kræfter er ikke tydeligere nogen steder end i en sammenligning af S-ethyltrimethylaminocysteinenzymet, som har en terminal positiv ladning, men ingen evne til at donere en hydrogenbinding, og S-acetamidocysteinenzymet, som har et amid N-H til potentiel donation af hydrogenbindinger, men som mangler en positiv ladning. Den lave katalytiske aktivitet af S-ethyltrimethylaminocysteinenzymet taler stærkt imod, at de coulombiske kræfter er effektive til stabilisering af overgangstilstande. Alt andet lige, falder energien af en vekselvirkning mellem ladning og ladning kun som den inverse af afstanden. Methylgrupperne pålægger methylgrupperne en øget afstand mellem den positive ladning på sidekæden og fosforyloxygenerne i forhold til afstanden i S-ethylaminocysteinenzymet. Alligevel er det usandsynligt, at denne afstand er stor nok til at forårsage den observerede >103-foldige reduktion i kcat/Km, især da de tre methylgrupper let kunne rummes i nærheden af fosforyloxygenerne (figur 2).
Styrken af en hydrogenbinding forventes at korrelere omvendt med pKa for den proton, der doneres, idet hydrogenbinding indebærer en vis grad af protonoverførsel.23 Som det fremgår af tabel 1, svarer stigninger i pKa faktisk til fald i ΔΔG‡ for semisyntetiske enzymer med sidekæder af sammenlignelig længde. For de semisyntetiske enzymer, hvor sidekædelængden er sammenlignelig med lysin, er sammenhængen imidlertid ikke lineær. Denne manglende linearitet kan skyldes, at pKa for hver sidekæde afhænger af dens særlige miljø i det native protein. Lys41’s pKa er således blevet bestemt til at være 9,0,24 og ikke 10,6 som anført for butylammoniumion i tabel 1. Forskellige sidekæder kan blive påvirket i forskelligt omfang. En anden, måske mere betydningsfuld kilde til ikke-linearitet er, at ladede arter har en tendens til at deltage i stærkere hydrogenbindinger end uladede arter. Dette fænomen er blevet observeret for proteiner25 såvel som for små molekyler, herunder aminer.26 Sammenligning af semisyntetiske enzymer med sidekæder, der er isosteriske, men som adskiller sig i formel ladning, skulle kunne afsløre en sådan tendens. For eksempel er sidekæderne i S-acetamidinocystein- og S-acetamidocystein-enzymerne i position 41 identiske bortset fra et af de to heteroatomer, der er knyttet til det terminale kulstof. Alligevel er forskellen i disse to isologe sidekæders evne til at binde til overgangstilstanden større end forventet ud fra deres syreindhold alene. Her er den brintbinding, der doneres fra et ladet acetamidin, 4 kcal/mol stærkere end den brintbinding, der doneres fra et uladet amid. Denne værdi er i overensstemmelse med andre data om den relative styrke af ladede og uladede hydrogenbindinger i protein-ligand-interaktioner.21 Endelig er det bemærkelsesværdigt, at selv om S-acetamidosidekæden mangler en formel ladning og har en relativt høj pKa, bidrager den stadig (om end i beskedent omfang) til katalysen. Dette resultat giver yderligere bevis for betydningen for katalysen af en hydrogenbinding, der doneres af rest 41.