Pyrosequencing er en metode til DNA-sekventering (bestemmelse af rækkefølgen af nukleotider i DNA) baseret på “sekventering ved syntese”-princippet, hvor sekventeringen udføres ved at detektere det nukleotid, der er inkorporeret af en DNA-polymerase. Pyrosequencing er baseret på lysdetektion på grundlag af en kædereaktion, når pyrofosfat frigives. Derfor navnet pyrosequencing.
Princippet for pyrosequencing blev første gang beskrevet i 1993 af Bertil Pettersson, Mathias Uhlen og Pål Nyren ved at kombinere fastfase-sekventeringsmetoden ved hjælp af streptavidinbelagte magnetiske perler med rekombinant DNA-polymerase uden 3´til 5´exonukleaseaktivitet (proof-reading) og luminescensdetektion ved hjælp af enzymet firefly luciferase. En blanding af tre enzymer (DNA-polymerase, ATP-sulfurylase og firefly luciferase) og et nukleotid (dNTP) tilsættes til enkeltstrenget DNA, der skal sekventeres, og inkorporeringen af nukleotid følges ved måling af det udsendte lys. Lysets intensitet bestemmer, om der er blevet inkorporeret 0, 1 eller flere nukleotider, og viser således, hvor mange komplementære nukleotider der er til stede på skabelonstrengen. Nucleotidblandingen fjernes, før den næste nucleotidblanding tilsættes. Denne proces gentages med hvert af de fire nukleotider, indtil DNA-sekvensen af den enkeltstrengede skabelon er bestemt.
En anden opløsningsbaseret metode til pyrosequencelering blev beskrevet i 1998 af Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen og Pål Nyren. I denne alternative metode introduceres et ekstra enzym apyrase til at fjerne nukleotider, der ikke inkorporeres af DNA-polymerasen. Dette gjorde det muligt at tilsætte enzymblandingen, herunder DNA-polymerase, luciferase og apyrase, ved starten og beholde den under hele proceduren, hvilket giver en enkel opsætning, der er egnet til automatisering. Et automatiseret instrument baseret på dette princip blev introduceret på markedet det følgende år af virksomheden Pyrosequencing.
En tredje mikrofluidisk variant af Pyrosequencing-metoden blev beskrevet i 2005 af Jonathan Rothberg og medarbejdere i virksomheden 454 Life Sciences. Denne alternative metode til Pyrosequencing var baseret på det oprindelige princip om at fastgøre det DNA, der skal sekventeres, til et fast underlag, og de viste, at sekventeringen kunne udføres meget parallelt ved hjælp af et mikrofabrikeret mikroarray. Dette gjorde det muligt at foretage DNA-sekventering med høj kapacitet, og et automatiseret instrument blev introduceret på markedet. Dette blev det første næste generations sekventeringsinstrument, der indledte en ny æra inden for genomforskning, og de hurtigt faldende priser på DNA-sekventering muliggjorde sekventering af hele genomet til overkommelige priser.