- Abstract
- 1 Indledning
- 2 Materialer og metoder
- 2.1 Vækst af H. marismortui på glukose, acetat, glukose/acetatblandinger og på peptider
- 2.2 Fremstilling af celleekstrakter
- 2.2. Protein blev bestemt ved Bradford-metoden med bovin serumalbumin som standard. 2.3 Bestemmelse af enzymaktiviteter
- 3 Resultater
- 3.1 Vækst af acetattilpassede celler på glukose
- 3.2 Vækst af glukosetilpassede celler på acetat
- 3.3 Vækst på glukose/acetatblandinger
- 3.4 Glukosetilpassede celler på peptider
- 4 Diskussion
- 4.1 Acetatdannelse i H. marismortui katalyseres af ACD som en del af “overflow”-metabolismen
- 4.2 Acetataktivering til acetyl-CoA i H. marismortui katalyseres af ACS
- 4.3 Glukosespecifik katabolitrepression i H. marismortui
- Author notes
Abstract
Haloarcula marismortui dannede acetat under aerob vækst på glukose og udnyttede acetat som vækstsubstrat. På glukose/acetat-blandinger blev der observeret diauxisk vækst med glukose som det foretrukne substrat. Reguleringen af enzymaktiviteter, der er relateret til glucose- og acetatmetabolisme, blev analyseret. Det blev konstateret, at både glukosedehydrogenase (GDH) og ADP-formende acetyl-CoA-syntetase (ACD) blev opreguleret i perioder med glukoseforbrug og acetatdannelse, mens både AMP-formende acetyl-CoA-syntetase (ACS) og malatsyntase (MS) blev nedreguleret. Omvendt blev der observeret en opregulering af ACS og MS og en nedregulering af ACD og GDH i perioder med acetatforbrug. MS blev også opreguleret under vækst på peptider i fravær af acetat. Ud fra disse data konkluderer vi, at en glukose-inducerbar ACD katalyserer acetatdannelsen, mens acetataktivering katalyseres af en acetat-inducerbar ACS; både ACS og MS induceres tilsyneladende af acetat og undertrykkes af glukose.
1 Indledning
Varierende halofile archaea, herunder Haloarcula marismortui, vokser på glukose, som nedbrydes via en modificeret, semifosforyleret Entner-Doudoroff (ED)-vej . Det er blevet vist, at der under eksponentiel vækst på glukose blev dannet betydelige mængder acetat . Nylige undersøgelser tyder på, at dannelsen af acetat fra acetyl-CoA i halofile arkæaer katalyseres af en ADP-dannende acetyl-CoA-syntetase (ACD) (acetyl-CoA + ADP + Pi⇆ acetat + ATP + CoA). Denne usædvanlige synthetase blev fundet i alle acetatdannende arkæaer, herunder anaerobe hypertermofile, og repræsenterer en ny mekanisme i prokaryoter for acetatdannelse og ATP-syntese. I anaerobe hypertermofile archaea, f.eks. Pyrococcus furiosus, udgør ACD den vigtigste energibesparende reaktion under sukker-, pyruvat- og peptidmetabolismen . I modsætning til arkæernes enenzym-mekanisme anvender alle bakterier den “klassiske” toenzym-mekanisme til omdannelse af acetyl-CoA til acetat, der involverer fosfatacetyltransferase (PTA) og acetatkinase (AK) .
Flere haloarchaea, herunder H. marismortui, Haloferax volcanii og Halorubrum saccharovorum, er blevet rapporteret til at vokse på acetat som substrat. Metabolismen af acetat indledes ved aktivering af det til acetyl-CoA. For nylig gav vi for første gang bevis for, at acetataktivering til acetyl-CoA i haloarchaea katalyseres af en AMP-dannende acetyl-CoA-syntetase (ACS) (acetat + ATP + CoA → acetyl-CoA + AMP + PPi) . ACS er det vigtigste enzym til acetataktivering for de fleste acetatudnyttende organismer fra alle tre livsdomæner . Kun få bakterier, f.eks. Corynebacterium glutamicum, og også den acetoklastiske methanogene arkæon Methanosarcina ssp. aktiverer acetat til acetyl-CoA via AK/PTA-parret . AK/PTA-vejen kan således fungere reversibelt in vivo, dvs. både i retning af acetatdannelse og også i retning af acetataktivering. I modsætning hertil tyder de første analyser på, at i haloarchaea ACD, den arkæale pendant til AK/PTA-parret, fungerer in vivo i retning af acetatdannelse, selv om enzymet katalyserer en reversibel reaktion in vitro.
For yderligere at belyse den fysiologiske rolle og for at få et første indblik i den substratafhængige regulering af acetat- og acetyl-CoA-konverterende enzymer i haloarchaea udførte vi substratforskydningsforsøg med H. marismortui og analyserede vækst på glukose, acetat, glukose/acetatblandinger og peptider. Under væksten blev aktivitetsprofiler for acetat- og acetyl-CoA-konverterende enzymer, ACD og ACS, samt for glukosedehydrogenase, det første enzym i glukosedegraderingen via den modificerede ED-vej, analyseret. Desuden blev aktiviteterne af malatsyntase, et nøgleenzym i glyoxylatcyklus, der foreslås at være operativt i haloarchaea , bestemt.
2 Materialer og metoder
2.1 Vækst af H. marismortui på glukose, acetat, glukose/acetatblandinger og på peptider
Haloarcula marismortui blev dyrket aerobt ved 37 °C på et komplekst medium indeholdende gærekstrakt, casaminoacider og desuden glukose og/eller acetat som tidligere beskrevet . Til vækst på glukose/acetat-blanding blev dette medium suppleret med 12,5 mM glukose og 30 mM acetat. Vækst af peptider blev foretaget på det komplekse medium i fravær af acetat og glukose. Vækstforsøgene blev udført i 2 l fermentorer (fairmen tec, Tyskland) med en omrøringshastighed på 500 omdrejninger pr. minut og en gennemstrømning af trykluft på 600 ml pr. minut. Væksten blev fulgt ved måling af den optiske tæthed ved 578 nm (ΔOD578). ΔOD578 på 1 svarede til et proteinindhold på 0,5-0,6 mg/ml. Glukose og acetat blev bestemt enzymatisk som beskrevet i .
2.2 Fremstilling af celleekstrakter
I forskellige vækstfaser blev celler af H. marismortui (100-200 ml af kulturen) høstet, og celleekstrakter blev fremstillet som beskrevet i .
2.2. Protein blev bestemt ved Bradford-metoden med bovin serumalbumin som standard.
2.3 Bestemmelse af enzymaktiviteter
Alle enzymassays blev udført under aerobe forhold ved 37 °C i kuvetter fyldt med 1 ml assayblanding. Hjælpeenzymerne blev generelt tilsat kort før reaktionens start, og det blev sikret, at disse enzymer ikke var hastighedsbegrænsende. En enhed (1 U) af enzymaktivitet er defineret som 1 μmol substrat, der forbruges, eller 1 μmol produkt, der dannes pr. minut.
-
Acetyl-CoA-syntetase (ADP-dannende) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) blev målt som beskrevet i .
-
Acetyl-CoA-syntetase (AMP-dannende) (ACS) (E.C. 6.2.1.13) (E.C. 6.2.1.13).C. 6.2.1.1.) blev overvåget som PPi og AMP-afhængig HSCoA-frigivelse fra acetyl-CoA i henhold til Srere et al. med Ellmans thiolreagens, 5′5-dithiobis (2-nitrobenzoesyre) (DTNB), ved at måle dannelsen af thiophenolat-anion ved 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1 ). Assayblandingen indeholdt 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetyl-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi og ekstrakt.
-
Malat-syntase (E.C. 4.1.3.2.) blev overvåget i et modificeret assay i henhold til Serrano et al. med DTNB. Assayblandingen indeholdt 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetyl-CoA, 0,5 mM glyoxylat og ekstrakt.
-
Glukosedehydrogenase (E.C. 1.1.1.1.47) blev målt i henhold til Johnsen et al. .
-
Acetatkinase (E.C. 2.7.2.1.) blev målt som beskrevet i .
-
Phosphotransacetylase (E.C. 2.3.1.8.) blev monitoreret som Pi-afhængig HSCoA-frigivelse fra acetyl-CoA med DTNB . Assayblandingen indeholdt 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetyl-CoA, 5 mM KH2PO4 og ekstrakt.
3 Resultater
For at undersøge den fysiologiske funktion og regulering af enzymer relateret til acetat- og acetyl-CoA-metabolisme, blev celler af H. marismortui, der var forvokset på forskellige substrater, flyttet til et medium indeholdende henholdsvis acetat og/eller glukose og peptider, og aktivitetsprofiler af ACD, ACS, GDH og MS blev analyseret.
3.1 Vækst af acetattilpassede celler på glukose
Efter en forsinkelsesfase voksede cellerne eksponentielt, og glukose blev fuldstændigt forbrugt. Parallelt med glukoseforbruget blev der dannet betydelige mængder acetat. I denne periode steg aktiviteterne af både GDH og ACD, mens aktiviteterne af ACS og MS, som var aktive i acetattilpassede celler, blev fuldstændig nedreguleret. I den stationære fase blev det udskilte acetat fuldstændig genbrugt, og både ACS- og MS-aktiviteterne steg, mens GDH- og ACD-aktiviteterne faldt (fig. 1).
Vækst af H. marismortui på glukose. Acetat-adapterede celler blev anvendt som inokulum. ΔOD578 (fyldte firkanter), glukosekoncentration (fyldte trekanter), acetatkoncentration (fyldte cirkler); enzymaktiviteter: ACD (fyldte ruder), GDH (omvendt fyldte trekanter), ACS (åbne cirkler), MS (åbne trekanter).
Vækst af H. marismortui på glukose. Acetat-adapterede celler blev anvendt som inokulum. ΔOD578 (fyldte firkanter), glukosekoncentration (fyldte trekanter), acetatkoncentration (fyldte cirkler); enzymaktiviteter: ACD (fyldte ruder), GDH (omvendt fyldte trekanter), ACS (åbne cirkler), MS (åbne trekanter).
3.2 Vækst af glukosetilpassede celler på acetat
Glukosetilpassede celler voksede på acetatholdigt medium i begyndelsen (ca. 30 timer) med en fordoblingstid på 10 timer op til en optisk tæthed (ΔOD578) på 1. I denne vækstfase blev der ikke observeret noget acetatforbrug, og cellerne voksede på de peptider, der var til stede i mediet. Efter denne periode voksede cellerne med en reduceret vækstrate op til en ΔOD578 på 1,8, og acetat blev fuldstændigt forbrugt. Under acetatforbruget faldt ACD- og GDH-aktiviteterne, mens ACS- og MS-aktiviteterne, som ikke kunne påvises i glukosetilpassede celler, steg. Stigningen i MS-aktiviteten begyndte under vækst på peptider, mens stigningen i ACS-aktiviteten var parallel med acetatforbruget (Fig. 2).
Vækst af H. marismortui på acetat. Glukosetilpassede celler blev anvendt som inokulum. Der blev anvendt de samme symboler som beskrevet i legenden til fig. 1.
Vækst af H. marismortui på acetat. Glukosetilpassede celler blev anvendt som inokulum. Der blev anvendt de samme symboler som beskrevet i legenden til fig. 1.
3.3 Vækst på glukose/acetatblandinger
Celler af H. marismortui tilpasset til gærekstrakt og casaminoacider blev overført til et medium indeholdende både glukose og acetat. Cellerne viste diauxisk vækst med sekventiel udnyttelse af først glukose og dernæst acetat. I den første vækstfase voksede cellerne op til en ΔOD578 på 4,0, og glukose blev forbrugt. Efter glukoseforbruget og en kort forsinkelsesfase gik cellerne ind i den anden vækstfase, hvor acetat blev metaboliseret, og cellerne voksede til en endelig ΔOD578 på 5,2. I den første vækstfase parallelt med glukoseforbruget steg ACD- og GDH-aktiviteterne, mens ACS-aktiviteten ikke kunne påvises, og MS-aktiviteten blev fuldstændig nedreguleret. I den anden vækstfase parallelt med acetatforbruget steg ACS- og MS-aktiviteterne, mens ACD- og GDH-aktiviteterne faldt (fig. 3).
Vækst af H. marismortui på glukose/acetatblanding. Celler, der var tilpasset komplekse bestanddele i fravær af glukose og acetat, blev anvendt som inokulum. Der er anvendt de samme symboler som beskrevet i legenden til fig. 1.
Vækst af H. marismortui på glukose/acetat-blanding. Celler, der var tilpasset komplekse bestanddele i fravær af glukose og acetat, blev anvendt som inokulum. Der er anvendt de samme symboler som beskrevet i legenden til fig. 1.
3.4 Glukosetilpassede celler på peptider
Glukosetilpassede celler blev flyttet til et medium indeholdende 0,25 % gærekstrakt og 0,5 % casaminoacider i fravær af både glukose og acetat. Cellerne voksede med en fordoblingstid på 13 timer op til en ΔOD578 på 2,5. Acetatdannelse kunne ikke påvises. Under eksponentiel vækst faldt ACD (fra 60 til 20 mU/mg) og GDH (fra 80 til 40 mU/mg), og MS-aktiviteten, som oprindeligt ikke kunne påvises, steg op til 20 mU/mg. ACS-aktiviteten kunne ikke påvises i den eksponentielle vækstfase, men steg i den stationære fase (13 mU/mg).
4 Diskussion
I denne artikel analyserede vi den fysiologiske rolle af acetat- og acetyl-CoA-konverterende enzymer (ACD, ACS) i H. marismortui og giver de første beviser for substratspecifik regulering af disse enzymer samt for GDH og MS. Dataene diskuteres i sammenligning med kendte bakteriesystemer.
4.1 Acetatdannelse i H. marismortui katalyseres af ACD som en del af “overflow”-metabolismen
Under vækst på glukose og på glukose/acetat-blandinger steg både ACD- og GDH-aktiviteterne parallelt med faser af glukoseforbrug og acetatdannelse (fig. 1 og 3). Omvendt faldt begge aktiviteter under vækst på acetat eller peptider. Disse data og fraværet af AK/PTA tyder på, at dannelsen af acetat i Haloarcula katalyseres af ACD. Den fysiologiske rolle af acetatdannelsen i H. marismortui og dens regulering under aerob vækst på glukose er ikke forstået; acetatdannelsen kan være en del af en “overflow”-metabolisme, som er blevet undersøgt ret detaljeret i forskellige bakterier, f.eks. Escherichia coli og Bacillus subtilis. Som i H. marismortui udskiller begge bakterier acetat under aerob vækst på overskydende glukose og genbruger det i den stationære fase . Det er blevet spekuleret, at udskillelse af acetat sker under forhold, hvor hastigheden af glykolyse overstiger hastigheden af efterfølgende veje, f.eks. citronsyrecyklus og respiration, der er nødvendig for fuldstændig oxidation af glukose . Under disse forhold omdannes acetyl-CoA til acetat og udskilles. I overensstemmelse med dette synspunkt viser transkriptionsanalyser med både E. coli og B. subtilis glukosespecifik induktion af glycolytiske gener og repression af gener fra citronsyrecyklus og respiration . En lignende glukosespecifik transkriptionel regulering, dvs. opregulering af glykolytiske gener i den modificerede Entner-Doudoroff-vej og nedregulering af nogle gener i citronsyrecyklus og respiration, er for nylig blevet rapporteret for den halofile archaeon H. volcanii. I haloarchaea er det således sandsynligt, at der i haloarchaea findes en glukosespecifik overløbsmetabolisme, der resulterer i acetatdannelse. Acetatdannelse i E. coli og B. subtilis involverer den bakterielle to-enzym-mekanisme via PTA og AK, mens acetatdannelse i Haloarcula katalyseres af ACD, den arkæale en-enzym-mekanisme. I både E. coli og B. subtilis blev det konstateret, at glukose inducerer de gener, der koder for pta- og ack-generne, hvilket indikerer en koordineret regulering af glykolyse og acetatdannelse. Indtil videre er transkriptionel regulering af den acetatdannende ACD i archaeonen H. marismortui ikke blevet analyseret. Den koordinerede regulering af GDH- og ACD-aktivitet tyder imidlertid på en lignende glukosespecifik transkriptionel regulering af både glykolyse ved den modificerede Entner-Doudoroff-vej og af acetatdannelse ved ACD.
Under aerob vækst på peptider dannede H. marismortui ikke acetat, og ACD-aktiviteten blev nedreguleret. I denne henseende adskiller Haloarcula sig fra bakterien E. coli, som danner betydelige mængder acetat under aerob vækst på peptider i løbet af en “overflow”-metabolisme . H. marismortui adskiller sig også fra den anaerobe hypertermofile archaeon P. furiosus og andre anaerobe, hypertermofile archaea, som danner store mængder acetat ved hjælp af ACD under anaerob vækst på både sukkerstoffer og peptider. Under anaerob peptid- og sukkerfermentering hos P. furiosus udgør acetatdannelse ved hjælp af ACD det vigtigste sted for ATP-dannelse via fosforylering på substratniveau ; i modsætning hertil bevares den meste energi under aerob nedbrydning af sukkerstoffer og peptider hos H. marismortui ved hjælp af elektrontransportfosforylering i respirationskæden, og derfor er acetatdannelse ved hjælp af ACD mindre vigtig eller overflødig. Således synes acetatdannelse ved ACD i Haloarcula at være begrænset til sukkermetabolisme i forbindelse med en “overflow”-metabolisme.
4.2 Acetataktivering til acetyl-CoA i H. marismortui katalyseres af ACS
Dette blev konkluderet ud fra opreguleringen af ACS-aktiviteten parallelt med acetatforbruget (fig. 1, 2, 3). En rolle for ACD i acetataktivering kunne udelukkes, da ACD blev nedreguleret i perioder med acetatforbrug. ACD i Haloarcula fungerer således in vivo kun i retning af acetatdannelse. ACS er også den mest almindelige mekanisme for acetataktivering i bakterier, hvor den er strengt reguleret; f.eks. i E. coli og B. subtilis induceres acs-genet af acetat og undertrykkes af glukose . I Haloarcula tyder opregulering af ACS-aktiviteten ved acetat og nedregulering ved glukose på en lignende regulering på transkriptionelt niveau som det, der er rapporteret for bakterier. Det skal bemærkes, at i modsætning til E. coli og B. subtilis aktiverer bakterien C. glutamicum acetat ved hjælp af en acetatinduceret AK/PTA-vej .
Aktiviteten af MS, et nøgleenzym i glyoxylatcyklusen, blev opreguleret i perioder med acetatforbrug i H. marismortui sammen med ACS, hvilket tyder på acetatspecifik koordineret regulering af ACS og den anaplerotiske glyoxylatcyklus. Både MS- og ACS-aktiviteten blev nedreguleret af glukose. Koordineret acetatspecifik induktion af gener for enzymer til acetataktivering (se ovenfor) og for glyoxylatvejen er blevet rapporteret for flere bakterier, herunder E. coli og C. glutamicum. For nylig er de første beviser for induktion af både malatsyntase- og isocitratlyase-gener ved acetat blevet givet for den halofile arkæon H. volcanii.
Den MS-aktivitet snarere end ACS-aktiviteten blev imidlertid også opreguleret under eksponentiel vækst på peptider i fravær af acetat, hvilket indikerer, at reguleringen af MS er mere kompleks og ikke begrænset til acetat. En rolle for MS (og for glyoxylatcyklus) i peptidmetabolismen kan forklares ved, at mange aminosyrer nedbrydes til acetyl-CoA, hvilket ville kræve en funktionel glyoxylatvej for anabolisme. Den stigning i ACS-aktiviteten, der blev observeret i den stationære fase under vækst på peptider, kan indtil videre ikke forklares, den kan skyldes et generelt stressrespons hos celler i stationær fase .
4.3 Glukosespecifik katabolitrepression i H. marismortui
Haloarcula marismortui viste diauxisk vækst på glukose/acetat-blandinger med glukose som foretrukket substrat, hvilket indikerer en form for katabolisk repression af acetatudnyttelse ved hjælp af glukose. Glukosespecifik katabolitrepression er hidtil ikke blevet analyseret i arkæaer. I bakterier er det molekylære grundlag for kulstofkatabolit-repression ved glukose blevet undersøgt i detaljer, f.eks. i E. coli og B. subtilis. Under vækst af C. glutamicum på glukose/acetat-blandinger blev der beskrevet monofasisk vækst med samtidig forbrug af acetat og glukose, mens acetat er det foretrukne substrat i Azotobacter vinelandii. De regulerende principper bag disse træk undersøges i øjeblikket.
Der er behov for yderligere undersøgelser for at underbygge den foreslåede substratspecifikke regulering af acetatdannende og acetataktiverende enzymer, ACD og ACS, i relation til acetat- og glukosemetabolisme på transkriptionelt niveau. Disse undersøgelser, som kræver oprensning og identifikation af de kodende gener for ACD og ACS fra H. marismortui, er i gang.
(
)
.
.
,
–
.
(
)
.
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
. Online publikation, doi:
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
Author notes
Editor: Dieter Jahn