Rekombinante lægemidler fra mikrobielle celler: en opdatering fra 2015

Cellefabrikker

Siden de tidlige rekombinante DNA-tider har den stadigt voksende forståelse af cellens fysiologi og stress og af faktorer, der er involveret i heterolog genekspression og proteinproduktion, gjort det muligt at anvende forskellige levende fabrikker, nemlig prokaryote og eukaryote celler, planter eller dyr. Ved at anvende disse systemer løser rekombinant produktion problemerne med tilgængelighed af kilder, betragtes som en biosikker og grøn proces og giver mulighed for at ændre aminosyresekvenserne og dermed proteinfunktionen for bedre at tilpasse produktet til en ønsket funktion . Der er et bredt og voksende spektrum af ekspressionssystemer, der er ved at blive tilgængelige til produktion af rekombinante proteiner . Escherichia coli var den fremherskende platform, da den biofarmaceutiske sektor opstod i 1980’erne, og den blev efterfulgt af implementeringen af gæren Saccharomyces cerevisiae . Begge systemer og de tilhørende genetiske metoder udviser en usædvanlig stor alsidighed og kan derfor tilpasses til forskellige produktionskrav . På trods af udforskningen af insektceller som et oprindeligt succesfuldt system, især til vaccineorienterede proteiner, er pattedyrcelle-linjer (især CHO-celler) i dag det fremherskende animalske cellesystem på grund af deres egnethed til at producere praktisk glykosylerede proteiner (fig. 1). Evnen til at foretage posttranslationsmodifikationer står i kontrast til komplekse ernæringsmæssige krav, langsom vækst og skrøbelighed samt relativt høje produktionstidspunkter og -omkostninger. Blandt de mange konventionelle og nye cellebaserede systemer til proteinproduktion er bakterier, gær og pattedyrcellelinjer således de mest almindelige i biofarma, og både prokaryote og eukaryote systemer udvikler sig konstant og konkurrerer om at forbedre deres egenskaber og intensiveres som foretrukne platforme for produktion af proteinlægemidler . Mens bakterier har mistet deres tidlige førende rolle på området , produceres ca. 30 % af de markedsførte biofarmaceutiske lægemidler stadig i dette system , hvilket understøttes af de prokaryote cellers usædvanlige fysiologiske og genetiske manipulerbarhed .

Det vigtigste formål med udviklingen af nye proteinproduktionsplatforme er faktisk at forbedre lægemidlets funktionalitet ved at opnå en vellykket proteinfoldning og posttranslationelle modifikationer, samtidig med at den lave kompleksitet og høje fleksibilitet, der er forbundet med prokaryotisk cellekultur, bevares. I denne sammenhæng giver grampositive bakterier som Bacillus megaterium og Lactococcus lactis mulighed for effektiv proteinsekretion i fravær af endotoksiske cellevægskomponenter, mens filamentøse svampe (som Trichoderma reesei, ), mos (Physcomitrella patens, ) og protozoer (Leishmania tarentolae, ) fremmer glykosyleringsmønstre, der ligner dem i pattedyrproteiner, men som stadig dyrkes ved hjælp af metoder, der er enklere end dem, der kræves af pattedyrceller. Omfattende beskrivelser af nye (bakterielle og ikke-bakterielle) platforme, der specifikt er rettet mod produktion af proteinpræparater af høj kvalitet, kan findes andetsteds . Den nylige udvikling af en endotoxinfri E. coli-stamme og dens anvendelse til fremstilling af proteiner og proteinmaterialer baner vejen for en omkostningseffektiv og alsidig produktion af proteiner til biomedicinsk brug ved at springe endotoxinfjernelse over og dermed øge biosikkerheden og reducere produktionsomkostningerne . Forhåbentlig vil alle disse nye systemer snart kunne tilbyde forbedrede produkter i stadig enkle og fuldt kontrollerede biofabrikationsmetoder.

Trends inden for protein-biofarmaceutiske produkter

Næsten 400 rekombinante proteinbaserede produkter er blevet fremstillet med succes og er godkendt som biofarmaceutiske produkter , et begreb, der henviser til terapeutiske produkter genereret af teknologier, der involverer levende organismer . Andre 1300 proteinkandidater er under udvikling, hvoraf ca. 50 % er i prækliniske undersøgelser og andre 33 % i kliniske forsøg (fig. 2). På denne baggrund kan der forudses en stigning i antallet af godkendelser i de kommende år. Humulin, der blev udviklet af Eli Lilly & Co i 70’erne, var Humulin, et rekombinant humant insulin fremstillet i bakterien E. coli , det første biofarmaceutiske lægemiddel, der blev godkendt (af FDA) i 1982 . Andre naturlige proteiner såsom hormoner, cytokiner og antistoffer (Orthoclone OKT3) var blandt de ni enkeltprodukter, der blev godkendt i 1980’erne (tabel 1). I dag er de terapeutiske områder, der har haft størst gavn af rekombinante biofarmaceutiske produkter, stofskiftesygdomme (f.eks. diabetes type 1, type 2, fedme eller hypoglykæmi), hæmatologiske sygdomme (f.eks. nyreanæmi, hæmofili A, blødnings- eller koagulationsforstyrrelser) og onkologi (f.eks. melanom, bryst- eller kolorektal cancer) med henholdsvis 24, 18 og 15 % af godkendelserne (figur 3). I denne henseende er onkologi et klart ekspanderende marked. I perioden 2010-2014 var 9 ud af 54 godkendte biofarmaceutiske produkter antitumorale lægemidler, idet kræft var den mest almindelige indikation i denne periode. Hvis man graver ned i de molekylære grundlag for biofarmaceutiske produkter, er der en klar tendens til antistofbaserede produkter. I samme periode (2010-2014) var 17 af de 54 godkendte proteinmedicinske lægemidler monoklonale antistoffer (31,5 %), sammenlignet med 11 % i perioden 1980-1989 . Desuden er seks af de ti mest solgte protein-biofarmaceutiske lægemidler på verdensplan i 2014 (tabel 2) antistoffer eller antistof-afledte proteiner (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Forrige, var biofarmaceutiske produkter rekombinante versioner af naturlige proteiner med samme aminosyresekvens som de respektive indfødte versioner (med kun mindre ændringer, ofte som følge af kloningsstrategien). Siden 1990’erne har en betydelig del af godkendelserne været baseret på stærkt modificerede former af rekombinante proteiner. Dette nye alternativ, der er baseret på protein- eller domænefusion og på trunkerede versioner, giver et bredt spektrum af kombinationsmuligheder for at opnå nye biofarmaceutiske stoffer med forskellige forenede aktiviteter, som ikke findes sammen i naturen.

Proteinlægemidler til kræftbehandling

Onkologi er en af de terapeutiske indikationer, der dominerer det biofarmaceutiske marked, da kræft er en af de vigtigste årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Kirurgi og strålebehandling er effektive til at helbrede kræft i tidlige sygdomsstadier; de kan dog ikke udrydde metastaserende sygdom. Tilstedeværelsen af mikrometastaser eller klinisk tydelige metastaser ved diagnosen kræver, at de anvendes i kombination med genotoksisk kemoterapi for at øge helbredelsesprocenten . Kemoterapiens succes har imidlertid været hæmmet af dens manglende selektivitet og specificitet, således at toksiciteten for normale væv begrænser den dosis, der kan gives til patienterne. Udviklingen af biofarmaceutiske produkter, der er i stand til at hæmme specifikke molekylære mål, der driver kræft (f.eks. monoklonale antistoffer anti-Her2-Trastuzumab- eller anti-VEGF-Bevacizumab-), går i denne retning .

Blandt markedsførte protein-biofarmaceutiske produkter anvendes næsten 24 % (94 produkter) i antitumorale terapier. De fleste af disse produkter anvendes til understøttende formål, der har til formål at minimere bivirkningerne af kemoterapi, normalt neutropeni eller anæmi (nogle repræsentative eksempler er vist i tabel 3). 19 ud af disse 94 produkter er ægte antitumorale lægemidler, hvoraf 69 % er fremstillet i E. coli (fig. 4) og er baseret på manipulerede aminosyresekvenser, proteinfusioner og enkelte proteindomæner (tabel 4).

Klar, er modificerede proteinversioner de mest udbredte i kræftterapier frem for naturlige polypeptider. Som relevante eksempler kan nævnes Ziv aflibercept, som er et rekombinant fusionsprotein produceret i CHO-celler, der anvendes mod colorectal cancer. Det består af dele af hver enkelt Vascular Endothelial Growth Factor Receptors (VEGFR1 og VEGFR2), der er fusioneret med den konstante fraktion (Fc) af et humant IgG1-immunoglobulin (fig. 5). Dette konstrukt fungerer som en lokkedue ved at binde sig til VEGF-A, VEGF-B og placentavækstfaktor (PlGF), som aktiverer VEGFR. Denne fælde forhindrer interaktionen mellem vækstfaktorerne og receptorerne og hæmmer VEGF-vejen, som er involveret i den angiogene proces . Denileukin diftitox er et rekombinant protein, der består af to difteritoksinfragmenter (A og B) og et humant interleukin-2 (fig. 5). Difterietoksin er et kraftigt eksotoksin, der udskilles af Corynebacterium diphteriae. På grund af sin særlige struktur er hele komplekset, der produceres i E. coli, i stand til at levere et cytotoksisk middel direkte til et specifikt mål. Der er to aktive hovedblokke, hvis funktion for det første er at levere selektivt det biofarmaceutiske stof (IL-2) og for det andet at forårsage cytotoksicitet (toksin A og B) . Fusionsproteinet binder sig til IL-2-receptoren, som kommer til udtryk i kræftceller (kutant T-celle lymfom). Når toxindelen er internaliseret, fremmer det katalytiske domæne celledøden gennem hæmning af proteinsyntesen .

Da målrettet lægemiddeloverførsel til kræft er et meget nyt og ekspanderende forskningsområde, er andre ikke-rekombinante, proteinbaserede biofarmaceutiske lægemidler også stærkt repræsenteret. Disse omfatter hovedsagelig antistof-lægemiddelkonjugater (ADC’er) såsom Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine eller nanopartikel-lægemiddelkonjugater såsom nab-paclitaxel . I disse tilfælde fungerer proteinmodstykket som et målrettet medium for konventionelle kemiske lægemidler. Igen er denne tilgang rettet mod selektiv lægemiddeloverførsel til specifikke målceller med det formål at øge den antitumorale aktivitet og samtidig reducere toksiciteten på normale celler og de dermed forbundne bivirkninger.

Produkter mod kræft, der gav de højeste indtægter i 2013, er vist i figur 6. Seks procent af disse produkter er rekombinante proteiner, hvilket understøtter idéen om, at produktion af rekombinante proteiner stadig er en stigende og lovende platform, der giver plads til vigtige fremskridt i den biofarmaceutiske sektor.