Stabilitetsundersøgelser af thiocolchicosid i bulk og kapsler ved hjælp af RP-HPTLC/Densitometri

Der er blevet etableret nogle analysemetoder, såsom LC-ESI-MS RP-HPLC og UV-spektrofotometrisk metode til bestemmelse af thiocolchicosid alene i bulk og farmaceutiske formuleringer.

Thiocolchicosid findes i kombination med mange andre lægemidler; derfor er flere metoder, såsom UV-spektrofotometriske , RP-HPLC og HPTLC-metoder, blevet undersøgt til bestemmelse af thiocolchicosid i kombinerede doseringsformer.

Den internationale konference om harmonisering (ICH-retningslinjerne) med titlen “Stability Testing of New Drug Substances and Products” kræver, at der kan udføres stresstest for at belyse det aktive stofs iboende stabilitetsegenskaber. En ideel stabilitetsindikerende metode er den, der opløser standardlægemidlet samt dets nedbrydningsprodukter . Det er derfor nødvendigt at udvikle en pålidelig og hurtig bestemmelsesmetode, som også kan anvendes til at opnå den optimale adskillelse af nedbrydningskomponenterne fra grundstoffet. Så vidt vi ved, er der imidlertid aldrig blevet nævnt nogen artikel i litteraturen om stabilitetsindikerende RP-HPTLC-bestemmelse af thiocolchicosid. Formålet med det arbejde, der er beskrevet i denne artikel, er at etablere betingelser for identifikation og kvantitativ analyse af thiocolchicosid i tilstedeværelse af dets nedbrydningsprodukter med henblik på vurdering af renheden af bulk-lægemidlet og stabiliteten af dets doseringsformer. Den stabilitetsindikerende RP-HPTLC-metodes egnethed til kvantitativ bestemmelse af thiocolchicosid blev bevist ved validering i overensstemmelse med kravene i ICH-retningslinjerne.

2. Eksperimentel

2.1. Kemikalier og reagenser

Thiocolchicosid blev opnået som en gaveprøve fra Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, Indien. Methanol af HPLC-kvalitet, HCl, NaOH og H2O2 blev købt fra Merck Chemicals, Indien.

2.2. HPTLC-instrumentering

Lægemiddelstandarden og prøverne blev spottet i form af bånd med en bredde på 6 mm med en CAMAG Linomat mikrolitersprøjte (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Schweiz) ved hjælp af en CAMAG Linomat 5-prøveapplikator (CAMAG Muttenz, Schweiz) med en konstant påføringshastighed på 150 nL pr. sekund. Pladerne blev forvasket med methanol og aktiveret ved 100 °C i 10 minutter inden kromatografi. Kromatografien blev udført på aluminiumsplader belagt med silicagel 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Tyskland). Der blev foretaget lineær stigende udvikling med methanol: vand (70 : 30 v/v) som mobil fase i et 20 × 10 cm glaskammer med dobbelt rullekammer (CAMAG Muttenz, Schweiz). Den optimerede mætningstid for den mobile fase i kammeret var 30 min. ved stuetemperatur (28 ± 2 °C). Længden af kromatogrammet var ca. 80 mm. Udviklingstiden for pladen var 25 min. Efter udviklingen blev pladerne tørret i luftstrøm med en lufttørrer. Derefter blev pletterne detekteret ved 377 nm med en CAMAG TLC Scanner 3 i absorbanstilstand, der blev betjent af winCATS-software version 1.3.0. Strålingskilden var en deuteriumlampe. Spaltenes dimensioner var 6 mm × 0,45 mm, og scanningshastigheden var 20 mm pr. sekund.

2.3. Fremstilling af standardopløsning

Standardopløsning af 1 mg/mL thiocolchicosid i methanol.

2.4. Undersøgelse af linearitet

Stock standardopløsning i intervallet 0,2 til 1,2 mL blev overført til seks separate 10 mL målekolber, og volumen blev suppleret med methanol. Fra hver af de ovennævnte opløsninger blev der påført 5 μL på RP-HPTLC-plader for at opnå en koncentration i intervallet 100 til 600 ng pr. bånd. Kalibreringsdiagrammet for metoden blev konstrueret som peakareal versus lægemiddelkoncentration.

2,5. Forberedelse af prøveopløsning

For at bestemme indholdet af thiocolchicosid i kapslen blev 20 kapsler (MYORIL, mærkningsanprisning: 8 mg thiocolchicosid pr. kapsel) vejet; indholdet af kapslerne blev fjernet; og gennemsnitsvægten blev bestemt. En mængde svarende til 8 mg thiocolchicosid blev overført til en 100 mL målekolbe indeholdende 50 mL methanol og soniceret i 10 min; volumen blev justeret til mærket og filtreret ved hjælp af Whatmann nr. 41-filterpapir. Et volumen på 5 mL blev fortyndet til 10 mL med methanol; den resulterende opløsning på 5 μL blev påført RP-HPTLC-plade til bestemmelse af thiocolchicosid. Pladerne blev udviklet og scannet som beskrevet ovenfor.

2.6. Metodevalidering

Metoden blev valideret for følgende parametre i overensstemmelse med ICH-retningslinjerne.

2.6.1. Præcision

Den gentagelige prøveanvendelse og måling af peakarealet blev udført ved hjælp af seks gentagelser af testkoncentrationen (400 ng pr. bånd af thiocolchicosid). Variationen inden for og mellem dagene for estimering af thiocolchicosid blev udført ved hjælp af tre gentagelser ved tre forskellige koncentrationsniveauer (200, 300 og 500 ng pr. bånd).

2.6.2. Detektionsgrænse (LOD) og kvantificeringsgrænse (LOQ)

For at bestemme detektions- og kvantificeringsgrænsen blev der anvendt thiocolchicosidkoncentrationer i den nederste del af kalibreringskurvens lineære interval. Fra stamstandardopløsningen blev thiocolchicosid 100, 120, 140, 160, 180 og 200 ng pr. bånd påført i tre eksemplarer på RP-HPTLC-pladen, og LOD og LOQ blev beregnet ved hjælp af følgende ligninger: hvor “” er standardafvigelse af toparealerne af stofferne (), taget som et mål for støj, og “” er hældningen af den tilsvarende kalibreringskurve.

2.6.3. Specificitet

Metodens specificitet blev kontrolleret ved at analysere lægemiddelstandard og prøve. Båndet for thiocolchicosid i prøven blev bekræftet ved at sammenligne værdierne og spektrene for båndet med værdierne og spektrene for lægemiddelstandarden. Peakrenheden af thiocolchicosid blev bekræftet ved at sammenligne spektrene på tre forskellige niveauer, dvs. båndens peak-start (), peak-apex () og peak-ende () positioner.

2.6.4. Robusthed

Metodens robusthed blev udført ved at analysere 400 ng thiocolchicosid af to forskellige analytikere under samme eksperimentelle og miljømæssige forhold.

2.6.5. Nøjagtighed

Ni bånd af thiocolchicosidprøveopløsning (200 ng pr. bånd) blev påført på pladen, og derefter blev den kendte mængde thiocolchicosid påført i tre eksemplarer ved 80, 100 og 120 % (160, 200 og 240 ng pr. bånd) af prøvekoncentrationen (200 ng pr. bånd) og analyseret på ny efter den foreslåede metode. Dette blev udført for at evaluere genfindingsundersøgelsen af lægemidlet ved forskellige niveauer i formuleringerne.

2.6.6. Robusthed

Ved små ændringer af sammensætningen af den mobile fase, mængden af mobil fase, tiden fra påføring til udvikling og tiden fra udvikling til scanning blev virkningerne på resultaterne undersøgt. Mobile faser med forskellige sammensætninger af methanol: vand (72 : 28 v/v) og methanol: vand (68 : 32 v/v) blev afprøvet, og der blev kørt kromatogrammer. Pladerne blev forvasket med methanol og aktiveret ved 80 ± 5 °C i 2, 5 og 8 minutter inden kromatografien. Metodens robusthed blev vurderet ved hjælp af seks gentagelser af den samme plet (400 ng pr. bånd af thiocolchicosid).

2.7. Tvungen nedbrydning af thiocolchicosid

2.7.1. Syre- og basehydrolyse

En nøjagtigt afvejet mængde på 10 mg thiocolochicosid blev opløst separat i 10 mL methanolisk opløsning af henholdsvis 1,0 M HCl og 0,5 M NaOH og refluxet i 30 min. ved 60 °C i mørke for at undgå sandsynlig nedbrydende virkning af lys. Et volumen på 1,0 mL af ovennævnte opløsninger blev udtaget separat, neutraliseret og fortyndet op til 10 mL med methanol. De resulterende opløsninger blev påført på RP-HPTLC-pladerne i triplikater (5 μL hver, dvs. 500 ng pr. bånd). Kromatogrammerne blev udviklet og scannet som beskrevet ovenfor.

2.7.2. Oxidativ nedbrydning

For oxidativ nedbrydning blev en nøjagtigt afvejet mængde på 10 mg thioclochicosid opløst separat i 10 mL methanolisk opløsning af henholdsvis 1% v/v H2O2 og 3% v/v H2O2 og opbevaret i mørke ved stuetemperatur i 30 min. Efter 30 min. blev der udtaget 1,0 mL af hver af de ovennævnte opløsninger og fortyndet op til 10 mL med methanol. De resulterende opløsninger blev påført på RP-HPTLC-plader i tre eksemplarer (5 μL hver, dvs. 500 ng pr. bånd). Kromatogrammerne blev udviklet og scannet som beskrevet ovenfor.

2.7.3. Nedbrydning ved tørvarme

En nøjagtigt afvejet mængde 10 mg thiocolchicosid blev opbevaret ved 70°C i 8 timer i en ovn. Den blev overført til en 10 mL målekolbe med methanol, og der blev fyldt op til mærket. 1,0 mL af ovennævnte opløsning blev udtaget og fortyndet op til 10 mL med methanol. Den resulterende opløsning blev påført på RP-HPTLC-pladen i tre eksemplarer (5 μL hver, dvs. 500 ng pr. bånd). Kromatogrammet blev udviklet og scannet som beskrevet ovenfor.

2.7.4. Fotoafbrydning

En nøjagtigt afvejet mængde 10 mg thiocolchicosid blev opløst i 10 mL methanol, og opløsningerne blev opbevaret i en periode på 24 timer i lys. En passende mængde på 1,0 mL af ovennævnte opløsning blev taget og fortyndet til 10 mL med methanol. Den resulterende opløsning blev påført på RP-HPTLC-pladen i tre eksemplarer (5 μL hver, dvs. 500 ng pr. bånd). Kromatogrammet blev udviklet og scannet som beskrevet ovenfor.

3. Resultater og diskussion

3.1. Udvikling af optimal mobilfase

For at vælge en passende mobilfase til adskillelse af thiocolchicosid blev der foretaget flere kørsler med mobile faser, der indeholdt opløsningsmidler med varierende polariteter ved forskellige koncentrationsniveauer. Blandt de forskellige kombinationer af mobile faser, der blev anvendt, gav den mobile fase bestående af methanol: vand (70 : 30 v/v) et skarpt og veldefineret peak ved en værdi på 0,60 ± 0,02 (figur 2). De velafgrænsede bånd blev fundet, når kammeret blev mættet med den mobile fase i 30 minutter ved stuetemperatur.

Figur 2

Kromatogram af thiocolchicosidstandard med ( 0,60 ± 0,02) ved 377 nm i methanol: vand (70 : 30 v/v) som mobil fase.

3.2. Kalibreringskurve

De lineære regressionsdata for kalibreringskurverne () viste en god lineær sammenhæng over koncentrationsområdet 100-600 ng pr. bånd. Den lineære regressionsligning blev fundet til , = 0,9984 (figur 3).

Figur 3

Kalibrationskurve for thiocolchicosid (100-600 ng pr. bånd).

3.3. Validering af metode

Den udviklede metode blev valideret i overensstemmelse med ICH-retningslinjerne.

Metodens præcision blev afsløret i form af % relativ standardafvigelse (% RSD) af peakarealet. Resultaterne (tabel 1) indskrev metodens lydpræcision, som blev bestemt ud fra hældningen af den laveste del af kalibreringsdiagrammet. LOD og LOQ blev fundet at være henholdsvis 9,77 ng og 29,63 ng, hvilket indikerer, at metodens følsomhed er tilstrækkelig.