Struktur af human lysosomal α-glucosidase – en vejledning til behandling af Pompes sygdom

Strukturel oversigt

GAA syntetiseres som et 110 kDa glycoprotein, som er målrettet til lysosomet via mannose-6-fosfatreceptoren og gennemgår i det sene endosomale/lysosomale kompartment en række proteolytiske og N-glykanprocesseringshændelser for at give en moden aktiv form, der består af fire tæt associerede peptider19,20. Da krystallisering af den kommercielle Myozyme®-prækursorform af rhGAA (Q57-C952) ikke gav krystaller, der diffrakterede ud over ~7 Å, og da proteinforstyrrelsesprædiktorer21 indikerede tilstedeværelsen af uordnede peptidregioner, udførte vi in situ proteolyse med α-chymotrypsin for at fjerne formodede fleksible overfladesløjfer, der hæmmer dannelsen af produktive krystalkontakter. Den proteolytiske behandling gav et polypeptid med ~5 kDa lavere masse end rhGAA-prækursoren (Fig. 2a), som krystalliserede let. Dette gjorde det muligt for os at indsamle diffraktionsdata, der strækker sig til 1,9 Å, og løse strukturen af rhGAA ved molekylær udskiftning (tabel 1). Den proteolytisk fordøjede form havde en aktivitet, der var sammenlignelig med den af forløberen (2,34 ± 0,06 og 2,26 ± 0,16 U mg-1 for henholdsvis forløberen og den modne form), hvilket indikerer, at α-chymotrypsinbehandlingen ikke ændrede rhGAA’s funktionalitet.

Krystalstrukturen af rhGAA svarer til den modne form af human placenta-GAAA og rhGAA20 (fig. 2b), hvilket tyder på, at behandling med α-chymotrypsin gav mulighed for fjernelse af protease-labile regioner (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 og A782-R794) på en måde, der er sammenlignelig med den proteolytiske modning, der finder sted in vivo. Den overordnede arkitektur af rhGAA ligner den af de humane glykosidhydrolasefamilie GH311-homologer, de intestinale børste-grænseenzymer maltase-glucoamylase (MGAM)22,23 og sucrase-isomaltase (SI)24 (Fig. 2c og supplerende Fig. 1). Et N-terminalt trefoil Type-P-domæne efterfølges af et β-bladdomæne, den katalytiske (β/α)8 tønde, der bærer to indsatser efter β-strenge β3 (indsats I) og β4 (indsats II), og proximale og distale β-bladdomæner ved C-terminus. Prækursorformen af rhGAA indeholder ~14 kDa kulhydrat, og syv glykosyleringssteder er blevet forudsagt og karakteriseret20. Vi observerede glykanstrukturer af forskellige længder for fem af dem i krystalstrukturen, navnlig ved N140, N233, N390, N470 og N652 (Fig. 2c og Supplerende Fig. 2). Vi påviste resterende forskelselektrontæthed ved N882, utilstrækkelig til at modellere en glykanstruktur, og observerede ikke forskelselektrontæthed nær N925.

Aktivt sted og inhibitorbinding

Den smalle substratbindingslomme af rhGAA er placeret nær de C-terminale ender af β-strenge i det katalytiske (β/α)8-domæne og er formet af en løkke fra det N-terminale β-ark-domæne og både indsatse I og II (Fig. 2c). GH31-enzymerne i familien GH31 katalyserer via en klassisk Koshland-dobbeltforskydningsreaktionsmekanisme med bevarelse af den anomeriske kulstofkonfiguration i produktet. Ud fra en tidlig karakterisering af det katalytiske sted for GAA25 og ved homologi med mekanistisk dissekerede medlemmer af familie GH3126,27 kan den katalytiske nukleofil og syre/base tildeles henholdsvis D518 og D616. For at få indsigt i rhGAA’s interaktion med det dokumenterede farmakologiske chaperon 1-deoxynojirimycin16,28 og dets derivat N-hydroxyethyl-deoxynojirimycin29 (henholdsvis DNJ og NHE-DNJ), udblødte vi rhGAA-krystaller med disse aktivitetsstedsrettede iminosukkerinhibitorer og opnåede for begge komplekser diffraktionsdata, der strækker sig til 2,0 Å opløsning (tabel 1). DNJ binder i en 4C1-konformation i substratbindingssubsite -130 og er stabiliseret af hydrogenbindinger til sidekæderne af D404, D518, R600, D616 og H674. Yderligere stabiliserende interaktioner leveres af hydrofobiske kontakter med W376, I441, W516, M519, W613 og F649 (fig. 3a, b). Bortset fra en 20° hældning i sidekæden af W376 sker der ingen større konformationsændringer ved DNJ-binding i rhGAA’s aktive sted. Dette er ikke tilfældet for binding af NHE-DNJ, som indtager samme stilling som DNJ, men hvor hydroxyethylsubstituenten inducerer væsentlige konformationsændringer i sidekæderne af M519 og W481 (fig. 3c, d). I denne ligandinducerede konformation etablerer rhGAA-resten W481, der er placeret på spidsen af insert I, et stabiliserende samspil med hydroxyethylsubstituenten af NHE-DNJ. Lignende konformationsændringer kan observeres ved binding af NHE-DNJ til den N-terminale underenhed af MGAM (NtMGAM)31 (Supplerende fig. 3a).

Substratgenkendelse og specificitet

For at samle en opfattelse af substratgenkendelse af rhGAA erhvervede vi diffraktionsdata, der strækker sig til 2,45 Å opløsning, for en rhGAA-krystal gennemvædet med acarbose, en ikke-spaltbar α-1,4-tetrasaccharid-substratanalog (tabel 1). I dette kompleks antager valienaminringen, der er indlejret i subsite -1, en 2H3 halvkædekonformation, men på trods af denne konformationsforskel i forhold til DNJ bundet i 4C1 halvkædekonformationen er hydrogenbindingsmønsteret i subsite -1 stort set identisk for de to forbindelser (Fig. 3e, f og Supplerende Fig. 3b). Det ikke-hydrolyserbare “interglykosidiske” nitrogen optager det katalytiske center og er hydrogenbundet til den katalytiske syre/base D616. 6-deoxyglucosyldelen i subsite + 1 etablerer via sine 2- og 3-hydroxylgrupper hydrogenbindinger med den konserverede R600 og med D282, der stammer fra en løkke i det N-terminale β-ark-domæne. Selv om de ikke er bevaret i sekvensen, interagerer resterne i denne løkke uvægerligt med kulhydratligander i alle tilgængelige krystalstrukturer af GH31-familiens medlemmer. Maltoseenheden af acarbose i subsites + 2 og + 3 foretager ingen direkte interaktioner med rhGAA og er snarere stabiliseret af krystalgitterpakningsinteraktioner og en vandformidlet kontakt med sidekæden af W618, der er placeret ved kanten af den substratbindende lomme. Denne mangel på interaktioner tyder på, at rhGAA kun har to produktive substratbindingssteder, subsites -1 og + 1, men interessant nok antager acarbose-maltose-delen bundet til rhGAA den samme overordnede positur, som når den er bundet til NtMGAM22, hvilket tyder på en funktionel rolle også for subsites + 2 og + 3 i rhGAA (Supplerende fig. 3c).

Glykogen er en stor polymer, der er opbygget af lineære kæder af α-1,4-bundne glukoserester, der bærer α-1,6-bundne forgreninger. I cytosolen nedbrydes energilagringspartiklen ved den samtidige virkning af glykogenphosphorylase og et debranchingenzym. I lysosomet er der ikke noget debranching-enzym til stede, og GAA skal sikre hydrolysen af både α-1,4- og α-1,6-glykosidiske bindinger. RhGAA viser imidlertid en klar præference for førstnævnte binding, da specificitetskonstanten for maltose er 32 gange højere sammenlignet med specificitetskonstanten for isomaltose (Supplerende tabel 2). For at afdække det strukturelle grundlag for den dobbelte substratspecificitet forsøgte vi at sætte rhGAA-krystaller i blød med det ikke-hydrolyserbare tetrasaccharid glucopyranosyl-α-(1,6)-thio-maltotriose. Denne fremgangsmåde mislykkedes imidlertid, sandsynligvis på grund af krystalkontakter, der hindrede indkvartering af tetrasaccharidet, som i kraft af α-1,6-bindingen er lidt længere end acarbose. Sidstnævnte er blevet observeret til knap nok at passe ind i den substratbindende kløft og støder tæt op til et symmetribeslægtet molekyle (fig. 3e). Vi udledte et α-1,6-bundet disaccharid bundet inden for rhGAA’s aktive sted ved en strukturel superposition af rhGAA med det katalytiske (β/α)8-domæne af Blautia obeum GAA i kompleks med isomaltose32 (rmsd på 1,50 Å for 318 justerede Cα-positioner). Modellen afslører, at der ikke opstår sterisk hindring ved akkommodation af en α-1,6-binding mellem subsite -1 og + 1, og at produktive hydrogenbindinger mellem glycopyranoseenheden i subsite + 1 og D282 opretholdes (fig. 4a, b). På grund af den øgede længde af α-1,6-bindingen i forhold til en α-1,4-binding er den stabiliserende hydrogenbinding med R600 imidlertid svækket, hvilket kan forklare enzymets lavere aktivitet på α-1,6-bindede grene.

Det sekundære substratbindingsdomæne

I rhGAA-acarbose-komplekset kunne vi observere acarvosin-delen af et andet acarbose-molekyle, der var anbragt i en lomme inden for det N-terminale trefoil Type-P-domæne, beliggende på den samme side af rhGAA, hvor det aktive sted er placeret, og 25 Å væk fra acarbose bundet deri (fig. 4c). Valienamin-delen hydrogenbindes med sine 4- og 6-hydroxylgrupper til hovedkædens nitrogen og oxygen af C127, hovedkædens oxygen af A93 og sidekæden af D91. Yderligere stabiliserende vekselvirkninger er stablingvekselvirkninger med P125 og W126. P125 og D91 er bevaret eller erstattet af konservative substitutioner i GH31-enzymerne i familien GH31, der omfatter et trefoil Type-P-domæne (Supplerende fig. 4a). Ved siden af det sekundære kulhydratbindingssted var overfladesløjfen G116-M122 blevet trimmet ved proteolytisk behandling. Det er tænkeligt, at fjernelsen af segmentet G116-M122, som er unikt for de lysosomale repræsentanter for GH31-familien (supplerende fig. 4a og b), kan bidrage til dannelsen af den sekundære substratbindingslomme. Man kunne forestille sig, at det sekundære acarbose-bindingssted på rhGAA repræsenterer et ægte substratbindingssted, der muligvis øger enzymets processivitet. Dette sted kunne også udgøre en farmakofore til in silico-screening af nye farmakologiske chaperoner. Især er et trisaccharid, der er afledt af acarbose, bundet til det N-terminale domæne af α-1,4-glucanlyase af GH31-familien fra Gracilariopsis lemaneiformis 33 i en position tæt på det sekundære substratbindingssted, der er beskrevet her (supplerende figur 5).

N-acetylcystein er et allosterisk farmakologisk chaperon

Det kendte farmaceutiske lægemiddel N-acetylcystein (NAC) har vist sig at virke som allosterisk farmakologisk chaperon, der øger stabiliteten af muteret endogent GAA og rhGAA, der anvendes til ERT, uden at påvirke den katalytiske aktivitet18. For at udnytte det terapeutiske potentiale af NAC til behandling af Pompes sygdom via strukturelle undersøgelser har vi undersøgt krystalstrukturen af rhGAA i kompleks med NAC. Kompleksets struktur med en opløsning på 1,83 Å, der blev opnået ved hjælp af krystalblødgøringseksperimenter (tabel 1), afslører to NAC-bindingssteder langt fra det aktive sted (fig. 4d, e), hvilket giver strukturelle beviser for, at NAC faktisk er et allosterisk chaperon, som forventet af funktionelle undersøgelser18. Vi fastslog via aktivitetsassays og differentiel scanningfluorimetri, at NAC stabiliserer lige godt rhGAA og det proteolytisk modnede enzym produceret i denne undersøgelse, og at chaperonen er specifik over for GAA, da NAC ikke har nogen stabiliserende virkning på en GH31-homolog fra ris (Supplerende figur 6a, b og Supplerende tabeller 3 og 4). I rhGAA-NAC-kompleksstrukturen er et NAC-molekyle, betegnet som NAC1, placeret ca. 30 Å væk fra det aktive sted, ved grænsefladen mellem (β/α)8-tønden og det distale β-ark-domæne (Fig. 4d). NAC1 binder sig til hovedkædens carboxyl af H432 via dets amid nitrogen, og carboxylfunktionen laver en vandformidlet kontakt med sidekæden af D513. Cβ-Sγ- og acetylgrupperne etablerer stacking-interaktioner med henholdsvis guanidin-gruppen i R437 og løkken G434-G435. Et andet, delvist (75 %) besat NAC-molekyle (NAC2), er anbragt ved grænsefladen mellem (β/α)8-tønden og det proximale β-ark-domæne i en afstand på 25 Å fra det aktive sted (fig. 4e). Carboxylfunktionen af NAC2 laver en vandmedieret kontakt med hovedkædens iltstof af L756, thiolen stabler sig mod sidekæden af Q757 og acetylgruppen stabler sig mod sidekæden af H742. De to NAC-molekyler etablerer færre og svagere interaktioner med rhGAA end chaperonerne DNJ og NHE-DNJ. Dette afspejler de højere koncentrationer af NAC, der er nødvendige for chaperonaktivitet (mM vs. µM), hvilket illustreres af K D på 11,57 ± 0,74 mM, som vi opnåede ved differential scanning fluorimetri, og af K i på 3,4 og 3,0 µM for henholdsvis DNJ og NHE-DNJ18,29. En sigmoidal mætningskurve, der passer bedst til de eksperimentelle punkter, understøtter de allosteriske NAC-allosteriske fuldt (NAC1) og delvist (NAC2) besatte bindingssteder (Supplerende fig. 6c). De stabelinteraktioner, der er etableret mellem acetylgrupperne i NAC1 og NAC2 og rhGAA, må bidrage væsentligt til bindingsenergien, da aminosyrer, der er beslægtet med NAC, såsom N-acetylserin og N-acetylglycin, ligeledes har en stabiliserende virkning på rhGAA, mens de ikke-acetylerede modstykker ikke har nogen virkning18. Strukturen af rhGAA-NAC-komplekset viser et fald i de atomare termiske forskydningsparametre for de rester, der omgiver de NAC-bindingssteder, i forhold til den ubundne rhGAA, hvilket peger i retning af en overordnet interdomænestabiliserende funktion drevet af NAC (supplerende figur 7a-d). I krystallen synes NAC også at udøve en antioxiderende virkning, da rest C938 er oxideret til sulfensyreformen i alle de krystalstrukturer, der er beskrevet her, bortset fra strukturen af rhGAA-NAC-komplekset (Supplerende fig. 8a, b).

NAC og iminosukkerstoffer viser forskellige chaperonprofiler

Nogle mutationer, der fører til Pompe-sygdom, reagerer på både NAC og iminosukkerstofferne DNJ og NB-DNJ, mens andre er specifikt målrettet mod det ene eller det andet farmakologiske chaperon16,17,18. Langt de fleste GAA-mutanter, der reagerer på iminosukkeres chaperonaktivitet, er placeret enten inden for rækkevidde af det aktive sted eller på strukturelle elementer, der bidrager til dets globale arkitektur. I Pompe-patient-, fibroblaster- og musemodeller er de GAA-mutanter, der reagerer mest på NAC (A445P, Y455F og L552P)18 , placeret på indsatse I og II, hvor de tilsvarende wild-type-rester bidrager til domænestabiliseringer. A445 definerer sammen med F487 grænserne for indsats I, og A445P-mutanten destabiliserer højst sandsynligt hele stilladset af indsats I (Supplerende fig. 9a). Sidekædens hydroxyl af Y455 på insert I interagerer med en lang løkke af det katalytiske domæne, mens sidekæden af L552 på insert II laver hydrofobiske interaktioner med rester fra det N-terminale β-ark-domæne (Supplerende fig. 9b, c). De respektive Y455F- og L552P-mutanter har helt sikkert en samlet destabiliserende effekt, som klart reddes af NAC. Derfor kan iminosukkeres chaperonvirkning betragtes som en konformationel redning af strukturelt forstyrrede aktive steder, mens virkningen af det allosteriske chaperon NAC synes at skyldes stabilisering af overordnede eller lokale konformationelle fluktuationer.