Coronavirus 2019 (COVID-19) er en smitsom sygdom, der har forårsaget en global pandemi med mere end 36 millioner smittede mennesker fra omkring 200 lande eller territorier, med mere end 1 million dødsfald til dato (Verdenssundhedsorganisationen (WHO), 2020). Det forårsagende agens for COVID-19, det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), antages at stamme fra flagermus, da det flagermusbårne coronavirus RaTG13 er den nærmeste genetiske slægtning til dato (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Flere arter er blevet undersøgt for at bestemme deres potentielle rolle som mellemværter (Shi et al., 2020). Desuden betragtes dyremodeller til at rekapitulere en COVID-19-lignende sygdom som en vigtig forskningslinje og er nødvendige for udvikling af terapeutiske lægemidler og profylaktiske forbindelser.
Suden flere modelundersøgelser, der foreslår potentielle dyrearter, der er modtagelige for SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), har flere eksperimentelle infektioner allerede vist, at der findes en bred vifte af modtagelige dyr. Specifikt er egyptisk frugtflagermus, fritte, golden syrisk hamster, kat, mus, der udtrykker humaniseret angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2), BALB/c-mus (ved hjælp af en muteret SARS-CoV-2 ved flere cellekulturpassager) og nogle ikke-menneskelige primatarter er permissive over for virusinfektion og udvikler sig fra subklinisk til mild til moderat respiratorisk sygdom (Bao et al, 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Ud fra et eksperimentelt synspunkt er hundes modtagelighed for SARS-CoV-2 begrænset, da inokulerede dyr delvist kan serokonvertere (Shi et al., 2020). Derimod resulterede intranasal inokulation af kylling, and og svin i ingen tegn på infektion (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Svin anvendes almindeligvis i forskning på grund af de ligheder, der findes med mennesker med hensyn til anatomi, genetik, fysiologi og også immunologi. Forsøg på svin vil sandsynligvis være mere forudsigende for terapeutiske og forebyggende behandlinger hos mennesker end forsøg på gnavere (Meurens et al., 2012). Da svin imidlertid ikke er modtagelige for SARS-CoV-2-infektion ved intranasal inokulation (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), fortjener muligheden for at udvikle en model for svineinfektion med dette virus ved hjælp af andre potentielle inokulationsveje at blive undersøgt. Den vigtigste begrundelse for at teste svin er, at ACE2-receptoren hos denne art er funktionel enten ved at transficere svine-ACE2 i HeLa-celler (som ikke udtrykker det menneskelige ACE2 konstitutivt) (Zhou et al., 2020) eller at pseudopartikler med S-proteinet fra SARS-CoV-2 er i stand til at inficere svinenyreceller (Letko et al., 2020). Desuden udtrykkes ACE2-proteinet i alle større væv hos svin som vurderet ved immunohistokemi (Xiao et al., 2020). For at etablere en formodet COVID-19-svinemodel undersøgte vi derfor effekten af forskellige naturlige og ikke-naturlige ruter af SARS-CoV-2-inokulation i tamsvin (Sus scrofa domesticus) for at etablere en formodet COVID-19-svinemodel.
Med henblik herpå blev fire grupper på fem 5- til 6-ugers konventionelle smågrise (Landrace × Large White) udvalgt og inokuleret ved hjælp af forskellige ruter: intranasalt (IN, 1,5 ml/nostril; samlet volumen på 3 ml), intratrachealt (IT, 3 ml) som tidligere beskrevet (Garcia-Morante et al, 2016), intramuskulært (IM, 1 ml i hver side af halsmusklerne; samlet volumen 2 ml) eller intravenøst (IV, 2 ml) med en slutdosis på 105,8 vævskulturinfektiøs dosis (TCID50) af SARS-CoV-2-isolatet (GISAID ID EPI_ISL_510689) pr. dyr. IT og IV-grupperne blev bedøvet med 10 mg/kg ketamin og 0,8 mg/kg xylazin før inokulationen. En passage-2 SARS-CoV-2 blev opformeret og titreret i Vero E6-celler (ATCC CRL-1586) efter samme protokol som for andre coronavirusser (Rodon et al., 2019). To ekstra grise blev anvendt som negative kontroller.
Alle dyr var seropositive over for porcin respiratorisk coronavirus, som bestemt ved en kommerciel ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Under hensyntagen til, at der ikke er beskrevet nogen antistofkrydsreaktivitet mellem alfa- og beta-coronavirus (Okba et al., 2020), blev dyrene holdt i undersøgelsen. En indledende reaktivitet mod PRCV var forventet, da dette virus er allestedsnærværende i den europæiske svinebesætning (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Dyreforsøgene blev godkendt af den institutionelle dyrevelfærdskomité for Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) og af den etiske kommission for dyreforsøg i den autonome regering i Catalonien og blev udført af certificeret personale. Eksperimenter med SARS-CoV-2 blev udført i faciliteterne på biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) i den biologiske indeslutningsenhed i IRTA-CReSA (Barcelona, Spanien).
2 og 22 dage efter inokulation (dpi) blev henholdsvis to og tre dyr/gruppe (IT, IM og IV) aflivet. Da det allerede er påvist, at IN-inokulation ikke er effektiv til at forårsage SARS-CoV-2-infektion (Shi et al., 2020), blev svin, der blev inokuleret ad denne vej, aflivet på dag 1 og 2 pi for at vurdere beviser for en mulig forbigående tidlig infektion i væv. Negative kontroldyr blev euthaniseret før forsøgets start. Prøverne blev indsamlet og behandlet som tidligere beskrevet (Vergara-Alert et al., 2017). Kort fortalt blev der udført komplette nekropsier på alle dyr. Flere væv (frontale, mediale og caudale turbinater; proximal, medial og distal trachea; stor og lille bronchus, venstre kraniale, mediodorsale og caudale lungeområder; nyre; lever; hjerte; og milt) blev taget, fikseret ved nedsænkning i 10% neutralbufferet formalin, indlejret i paraffin og snittet ved 3 µm for at forberede objektglas. Histologiske objektglas blev farvet med hæmatoxylin og eosin (HE) for at vurdere eventuelle mikroskopiske læsioner. Desuden blev de samme væv plus ileum, cervikal lymfeknude (LN), mediastinal LN, mesenterisk LN, olfaktorisk pære, tonsil, thymus, parotis spytkirtel, binyrebark, bugspytkirtel, hjernestammen, øjenlåg og knoglemarv også taget i Dulbecco’s modificeret Eagle-medium (DMEM) i rør med perler for at udføre SARS-CoV-2 upE-gendetektion ved RT-qPCR (Corman et al., 2020). Der blev også taget nasale og rektale svaberprøver (dagligt i den første uge og ved 14 og 22 dpi) med henblik på at analysere dem for tilstedeværelse af viralt RNA ved hjælp af ovennævnte RT-qPCR. Serumprøver, der blev udtaget på dag 0, 14 og 22 pi, blev testet for tilstedeværelsen af antistoffer mod SARS-CoV-2 spike S1 + S2 og nukleokapsid (N)-proteiner ved hjælp af interne ELISA’er (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Der blev også udført et virusneutraliseringsassay efter en tidligere protokol med en mindre ændring (Rodon et al., 2020), idet serielle fortyndinger af sera og SARS-CoV-2 blev inkuberet i 1 time ved 37 °C før pladeassayet blev udført.
Alle dyr blev overvåget dagligt, men ingen af dem viste kliniske tegn efter SARS-CoV-2 inokulation. Der blev heller ikke fundet nogen grove eller mikroskopiske læsioner, der kunne tilskrives SARS-CoV-2-infektion, hos nogen af de undersøgte dyr fra alle inokulationsgrupper samt kontrolgrupperne (data ikke vist).
Ingen af svinene havde nasal eller rektal udskillelse af viralt RNA. Proximal trachea fra et IN-inokuleret dyr var positiv ved 1 dpi for viralt RNA (Cq = 24,36). De resterende væv fra dette dyr og resten af svinene var negative for RT-qPCR (qPCR-detektionsgrænse på 38,6 cyklusser).
Efter 14 og 22 dpi kunne der påvises lave niveauer af antistoffer rettet mod Spike-proteinet hos alle dyr fra IM- og IV-grupperne (figur 1a). Desuden viste disse svin også neutraliserende antistoftiter ved 22 dpi (fra 74 til 317 SNT50 reciprok fortyndingstiter) (figur 1b). Der blev også fundet lave antistofniveauer, der var rettet mod N-proteinet, hos et ud af tre IM- og alle IV-inokulerede dyr ved forsøgets afslutning (data ikke vist). Det er vigtigt at bemærke, at et enkelt dyr fra IT-gruppen ikke viste antistoffer mod S-proteinet, men havde antistoffer mod N-proteinet samt neutraliserende titre (SNT50 reciprok fortyndingstiter på 29) på dag 0 pi, hvilket kunne tyde på en potentiel krydsreaktion med et andet coronavirus, der inficerer svin. Det skal bemærkes, at disse antistoffer mod N-proteinet faldt, da forsøget var afsluttet, hvilket tyder på, at de var af moderlig oprindelse. Desuden viste dette dyr ikke seroneutraliserende antistoffer ved 22 dpi (figur 1b).
De foreliggende data viser, at SARS-CoV-2 ikke var i stand til at inficere svin ad nogen af de testede ruter, nemlig IN, IT, IM og IV. Vores indsats bekræfter derfor tidligere forsøg, der viser manglende modtagelighed for infektion af svin (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), selv om det kan bruges til at vurdere immunogeniciteten af de kommende vaccinekandidater.
Væsentligt er, at den aktuelle undersøgelse går videre end andre undersøgelser med SARS-CoV-2 og svin, da vi testede et bredere antal inokulationsveje. Ingen af dem resulterede dog i en produktiv infektion hos smågrise. Et vigtigt resultat af denne undersøgelse var beviset for serokonversion mod Spike-glykoproteinet på dag 14 og 22 pi og tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer på dag 22 pi hos svin, der blev inokuleret ad parenterale veje (IM og IV). I betragtning af forsøgets korte varighed (22 dage) understreger en sådan serokonversion den potentielle interesse af grisen for at blive anvendt i immunogenicitetsundersøgelser for SARS-CoV-2. Faktisk er der bred anerkendelse af svins interesse som en egnet dyremodel for immunologi samt fysiologi, farmakologi og kirurgi, der kan anvendes inden for humanmedicin (Rothkötter, 2009).
Sammenfattende bekræfter den foreliggende undersøgelse, at smågrise ikke er en egnet dyremodel for COVID-19, men dens potentielle anvendelighed som model for immunogenicitet i prækliniske vaccineudviklingsundersøgelser fortjener yderligere undersøgelse.