To aminosyrerester bestemmer 2-APB-følsomheden af ionkanalerne TRPV3 og TRPV4

Resultater

Identifikation af mutationer, der specifikt påvirker 2-APB-responser.

Vi screenede et mus TRPV3-mutantbibliotek bestående af ≈14.000 cDNA-konstruktioner med i gennemsnit 2,5 mutationer pr. klon, der er genereret ved fejlbehæftet PCR. Mutantkonstruktioner blev transficeret i humane embryonale nyreceller (HEK293), og calciumresponser fremkaldt af varme (42 °C), 25 μM 2-APB og 1.75 mM kamfer blev overvåget i en fluorescensbillederpladelæser (FLIPR). Vi har for nylig beskrevet identifikationen af rester, der specifikt er nødvendige for TRPV3 varmeaktivering (20). Her fokuserede vi på 2-APB- og kamferdatasættet for at identificere rester, der specifikt kræves for kemiske reaktioner.

Specifikt udvalgte vi kloner, der viste normale reaktioner for et kemikalie, men signifikant reduceret aktivering af det andet (for udvælgelseskriterier, se Metoder). Positive kloner blev plukket, genvokset, og fulde dosis-respons-kurver mod hver stimulus blev målt, og EC50-værdierne blev beregnet (se metoder). Syv mutantkloner blev bekræftet som specifikt 2-APB-mangelfulde og blev sekventeret. Det er bemærkelsesværdigt, at alle 7 kloner indeholdt mutationer i 1 af 2 rester. Den første, histidin (H) 426, findes i det cytoplasmatiske N-terminusområde mellem ankyrin- og transmembrandomænet. Vi identificerede 4 forskellige substitutioner af H426 i screeningen (tabel 1). Den anden, arginin (R) 696, er til stede i den C-terminale cytoplasmatiske TRP-boks (IWRLQR), et konserveret domæne i TRP-kanaler (2, 3). De 3 mutationer ved denne rest har den samme nært beslægtede arginin- til lysin-substitution. Alle 7 mutationer forårsagede alvorlige underskud i 2-APB-reaktioner uden at påvirke kamferreaktioner (tabel 1). Selv om der også blev identificeret nogle kamfer-deficiente kloner, var der tale om relativt mere subtile mutationer, som ændrede EC50-værdierne for kamfer ≈2 gange eller mindre (data ikke vist). Af denne grund fokuserede vi denne undersøgelse på de 2 rester, der forårsager specifikt >10-foldig 2-APB-mangel.

Initial elektrofysiologisk karakterisering af TRPV3-H426- og TRPV3-R696-kanaler.

FLIPR er en indirekte måde at måle ionkanalaktivitet på. For at bekræfte vores FLIPR-resultater brugte vi patch clamp-teknik og målte helcellestrømme af wild-type mus TRPV3, TRPV3-H426N og TRPV3-R696K, når 2-APB (1 μM til 3 mM) eller kamfer (0,3 til 20 mM) blev individuelt badet påført fra lave til høje koncentrationer (Fig. 1 og Fig. S1). På en koncentrationsafhængig måde aktiverede 2-APB strømme i HEK293-celler transficeret med wild-type TRPV3 med gennemsnitlige EC50-værdier på 25.9 ± 0.3 (nHill = 2.3) og 36.8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) ved henholdsvis +100 og -100 mV (Fig. 1A; Fig. S1A); 2-APB inducerede ikke målbare strømme i HEK293-celler, der var transficeret med TRPV3-H426N op til 100 μM. Koncentrationer af 2-APB, der er mættende for wild-type TRPV3 (0,3 til 3 mM), var imidlertid i stand til at aktivere strømme i denne mutant på en koncentrationsafhængig måde (Fig. 1A; Fig. S1A). Følgelig viste TRPV3-H426N en >10-foldig EC50-skift af 2-APB-afhængig aktivering, og svaret nåede aldrig mætning. I parallelle eksperimenter aktiverede kamfer også strømme i HEK293-celler transficeret med wild-type TRPV3 på en koncentrationsafhængig måde med EC50-værdier på 6.7 ± 0.1 (nHill = 7.8) og 7.0 ± 0.1 mM (nHill = 8.4) ved henholdsvis +100 og -100 mV. Det er vigtigt, at der blev observeret wild-type-lignende reaktioner på kamfer i HEK293-celler transficeret med TRPV3-H426N , hvilket bekræfter, at kamferaktivering er uændret i denne mutant (Fig. 1A; Fig. S1B).

I helcelle-patch-clamp-eksperimenter inducerede 2-APB også minimal TRPV3-R696K-aktivering. Ved +100 mV begyndte 2-APB at aktivere HEK293-celler, der udtrykker denne mutantkanal ved ≈3 μM, og nåede mætning ved 30 μM, med en EC50 på 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Højere koncentrationer af 2-APB (>30 μM) fremkaldte en desensibiliserende strøm med et “off-respons” efter udvaskning af 2-APB, et fænomen, der beskrives i detaljer nedenfor. Ved -100 mV formåede 2-APB imidlertid ikke at aktivere R696K-mutantkanalerne, selv ved 1 mM (Fig. 1B; Fig. S1A). Det maksimale 2-APB-respons ved 1 mM ved -100 mV var -2.3 ± 1.4 pA/pF (n = 6), hvilket er betydeligt mindre (>10-fold) end for TRPV3-kanaler af vildtype (-482.1 ± 69.2 pA/pF ved 300 μM, n = 17), hvilket tyder på, at det maksimale kanalsvar fremkaldt af 2-APB er nedsat i TRPV3-R696K-mutanten. Imidlertid aktiverede kamfer imidlertid lignende responser til TRPV3- og TRPV3-R696K-transficerede HEK293-celler (Fig. 1B; Fig. S1B). Derfor bekræftede de indledende elektrofysiologiske data vores screeningsresultater, at TRPV3-H426N- og TRPV3-R696K-mutanter er mangelfulde i 2-APB-reaktivitet uden at påvirke den overordnede kanalfunktion som testet ved deres evne til at reagere på kamfer.

Vi spurgte derefter, hvilke sidekædeegenskaber af H426 og R696 der er afgørende for TRPV3-aktivering af 2-APB. Vi muterede individuelt positionerne 426 og 696 til alle andre aminosyrer og målte FLIPR-dosisresponskurver for både 2-APB og kamfer. Interessant nok havde alle H426-mutanterne nedsatte 2-APB-responser med en stærk (>10-foldig) stigning i EC50-værdierne (tabel S1). De fleste af mutanterne havde normale kamferresponser undtagen den helixbrydende prolin-substitution, som viste ≈2-dobbelt stigning i kamfer-EC50. Dataene er i overensstemmelse med resultatet af vores primære screening, der identificerede 4 forskellige substitutioner, der resulterede i 2-APB-mangel på denne position. Mutantkanaler med aromatiske sidekæder F, T og W reagerede ikke på hverken kamfer eller 2-APB. De fleste R696-mutanter viste imidlertid reducerede 2-APB-responser, men havde også nedsatte maksimale kamferresponser (20 mM), hvilket indikerer, at disse mutationer påvirker den samlede kanaludtryk eller funktion (Tabel S2). Dette resultat er også i overensstemmelse med vores første resultat fra den primære screening, hvor kun lysinsubstitutionen blev identificeret som værende specifikt krævet for 2-APB ved denne rest. R696F viste også et vist 2-APB-specifikt underskud, selv om maksimale kamferresponser blev påvirket en smule. Mutanterne R696D, R696G, R696N, R696P, R696S og R696T viste ikke signifikante reaktioner på hverken 2-APB eller kamfer sammenlignet med pcDNA-vektortransficerede celler.

Voltageafhængigt respons forblev intakt i 2-APB-mutanter.

Voltageafhængighed har vist sig at have vigtige roller i TRP-kanalaktivering og gating (1, 10-12, 21). I fravær af kemiske stimulatorer (f.eks. kamfer eller 2-APB) aktiverede spændingstrin fra -120 til +180 mV (20 mV-trin) ikke strømme i HEK293-celler transficeret med wild-type TRPV3, hvilket indikerer, at TRPV3 (i modsætning til TRPV1 og TRPM8) ikke aktiveres af spænding alene ved det område, der blev testet her (20, 22). I tilstedeværelse af 30 μM 2-APB blev der imidlertid aktiveret en spændingsafhængig strøm (Fig. S2A). Som forventet blev der ikke set nogen påviselig spændingsmoduleret strøm i TRPV3-H426N, når den blev behandlet med 30 μM 2-APB (Fig. S2B) (Fig. S2B). Imidlertid fremkaldte 6 mM kamfer en spændingsafhængig strøm i HEK293-celler, der udtrykker TRPV3 af vild type (V1/2 på 81,3 ± 2,6 mV) (Fig. S2 A og D) og TRPV3-H426N (V1/2 på 81,3 ± 2,5 mV) (Fig. S2 B og D). I lighed med TRPVV3-H426N var der ingen påviselig spændingsmoduleret strøm i TRPV3-R696K, når den blev behandlet med 30 μM 2-APB (Fig. S2C). Imidlertid aktiverede kamfer en spændingsafhængig strøm med en V1/2 på 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C og D). Disse resultater indikerer, at spændingsmodulering er intakt i TRPVV3-H426N og TRPV3-R696K, og indebærer, at tab af spændingsafhængighed sandsynligvis ikke er årsagen til nedsat respons på 2-APB i disse mutantkanaler.

Temperaturfølsomhed af TRPV3-H426N og TRPV3-R696K.

Temperaturfølsomhed er et kendetegn for TRPV3-kanalens funktion (14, 16, 23). Derfor spurgte vi, om temperaturaktivering var ændret i TRPVV3-H426N- og TRPV3-R696K-kloner. Vi målte temperaturaktivering (25 til 42 °C) af HEK293-celler transficeret med wild-type TRPV3, TRPV3-H426N eller TRPV3-R696K-mutant i et FLIPR-assay. Varmereaktioner af TRPV3-H426N var enten lig med eller lidt større end wild-type TRPV3-reaktioner (n = 4 eksperimenter), hvilket tyder på, at 2-APB- og varmeaktivering kan adskilles (Fig. S2E; og data ikke vist). Varmereaktioner i TRPV3-R696K var imidlertid meget mindre sammenlignet med vild type (n = 3 eksperimenter), hvilket tyder på, at denne mutant ikke specifikt ændrer 2-APB-aktivering (Fig. S2E).

Kalciumafhængig desensibilisering af TRPV3-R696K.

Et interessant træk ved 2-APB-responset i TRPV3-R696K-transficerede HEK293-celler er hurtig desensibilisering ved >30 μM 2-APB og et off-respons på 2-APB ved høje koncentrationer (Fig. S3). Dette fænomen står i modsætning til wild-type TRPV3, som sensibiliserer som reaktion på gentagen/kontinuerlig stimulering af kemikalier eller varme (14, 16). Den mekanisme, der ligger til grund for TRPVV3-sensibilisering, foreslås at være et tab af calciumhæmning af denne kanal (22). Da desensibilisering af de fleste andre TRP-kanaler (såsom TRPV1 og TRPA1) til kemiske eller temperaturstimuli også afhænger af ekstracellulær calcium (24, 25), satte vi os for at teste, om ekstracellulær calcium har en rolle i 2-APB-fremkaldte desensibiliseringsreaktioner i TRVP3-R696K. Overraskende nok aktiverede 100 μM 2-APB i fravær af ekstracelullært calcium en robust, wild-type-lignende indadgående og udadgående strømme i TRPVV3-R696K (strømtæthed af TRPVV3-R696K: 755.7 ± 200.0 pA/pF ved +100 mV, -641.2 ± 133.9 pA/pF ved -100 mV (n = 5); wild-type TRPV3: 615.0 ± 266.7 pA/pF ved +100 mV, og -471.0 ± 83.2 pA/pF ved -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A og B). Dette resultat tyder på, at udskiftning af et arginin med et lysin ved position 696 i TRP-boksen af TRPV3 driver kanalen ind i en desensibiliserende tilstand ved 2-APB-, men ikke kamfer-stimulering på en calciumafhængig måde. En formodet Ca2+-bindende rest i pore loop-domænet, aspartat 641, er bevaret blandt alle TRPV-kanaler og er kritisk for permeationsegenskaberne af TRP-kanaler (26, 27). Mutation af D641 til asparagin (N) har vist sig at reducere rutheniumrød blokering og høj affinitet ekstracelullær calciumhæmning af TRPV3 og andre TRP-kanaler med høj affinitet (17, 22, 26, 27). Derfor undersøgte vi, om D641N-mutationen kunne afhjælpe TRPV3-R696K-klonen fra calciumafhængigt tab af 2-APB-respons. I et FLIPR-assay havde TRPV3-D641N en EC50 på 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), hvilket er ca. halvdelen af værdien af wild-type TRPV3 (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Dobbeltmutanten TRVP3-D641N/R696K havde en EC50 på 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), hvilket viser, at D641N-mutationen fuldt ud gendannede 2-APB-responset hos TRPV3-R696K. Som forventet var kamferresponset ens blandt TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N og TRPV3-D641N/R696K (fig. S4 C og D). Disse undersøgelser viser, at TRPV3-R696 ikke udelukkende er en 2-APB-mutation. De observerede underskud er calciummedierede og påvirker 2-APB-, men ikke kamferresponser.

Den 2-APB-følsomhed i TRPV3-ortologer.

Aminosyrekonserveringer og variationer blandt ortologer er nyttige værktøjer til at dissekere struktur-funktionsforhold af proteiner, herunder TRP-kanaler (28, 29). Derfor spurgte vi, om disse TRPVV3-ortologer har sammenlignelige kamfer- og 2-APB-reaktioner. Faktisk har menneskelige, hunde- og frø TRPV3-kanaler, som har histidiner på musens ækvivalente position 426 (Fig. 2A), lignende 2-APB-responser, når de overeksprimeres i HEK293-celler (selv om kamferresponser i Xenopus tropicalis TRPV3 var nedsat sammenlignet med wild-type mus TRPV3) (Fig. 2C). Som forventet blev 2-APB-koncentrationsresponskurver stærkt forskudt til højre i hver af disse TRPV3-ortologer, når H426 i menneske, hund og frø blev muteret til N, når H426 blev muteret til N (Fig. 2B). Igen mindskede denne mutation ikke kamferfølsomheden sammenlignet med TRPV3-ortologer af vild type (Fig. 2C). Tværtimod havde både humane og frø TRPV3 H426N-mutanter af TRPV3 H426N en lidt højere kamferfølsomhed end deres wild-type-modstykker. Disse resultater tyder på, at 2-APB-aktiveringsmekanismen for TRPV3 kan være bevaret på tværs af forskellige arter.

Det er interessant, at selv om R696 er bevaret i TRP-boksen i TRPV3 blandt alle arter, er den position, der svarer til mus 426 i kylling TRPV3 (cTRPV3), et N (427). Som vist ovenfor forstyrrer en H-N-substitution på 426-rest i pattedyr- eller amfibiearter de korrekte 2-APB-reaktioner (Fig. 2A). I overensstemmelse med at denne rest er vigtig for 2-APB-responser, er EC50 af 2-APB i cTRPV3 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) sammenlignet med 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) for TRPV3 i mus. Det er slående, at mutering af N427 til H forskød koncentrationsresponskurven for 2-APB betydeligt til venstre (EC50 på 6.1 ± 0.9 μM, nHill = 2.3), mens EC50-værdien for kamfer blev uændret (Fig. 3A). Helcelle-patchklemmeoptagelse bekræftede, at 2-APB-koncentrationsresponskurven var stærkt forskudt til venstre i kylling TRPV3-N427H sammenlignet med wild-type cTRPV3 ved både +100 og -100 mV (Fig. 3B). Enkeltkanaloptagelser afslørede næsten 200-dobbelt forøgelse af kanalåbninger over det basale niveau ved 25 μM 2-APB i inside-out patches fra cTRPV3-N427H-eksprimerende celler (n = 7), mens der ikke blev observeret nogen signifikante ændringer i inside-out patches fra wild-type cTRPV3-eksprimerende HEK293-celler (n = 5). Imidlertid øgede 6 mM kamfer kraftigt enkeltkanalåbninger i inside-out patches fra HEK293-celler transficeret med enten wild-type cTRPV3 eller cTRPV3-N427H-mutant på lignende niveauer (fig. 3 C-E). Derfor øger en enkelt punktmutation i kylling TRPV3 specifikt dens følsomhed over for 2-APB.

2-APB følsomhed i relaterede ThermoTRP’er: TRPV1, TRPV2 og TRPV4.

Pattedyrs TRPV3 er nært beslægtet med TRPV1 (39% aminosyrehomologi), TRPV2 (36% homologi) og TRPV4 (38% homologi). Det er interessant, at 2-APB er en fælles agonist for TRPV1, TRPV2 og TRPV3, men ikke TRPV4 (18). Derfor spurgte vi, om der findes en fælles mekanisme for 2-APB virkning på disse beslægtede ionkanaler. Den tilsvarende position for mus TRPV3 His-426 i TRPV3 er N i TRPV1 (N419), TRPV2 (N379) og TRPV4 (N456) (Fig. 4A; Fig. S5A). Den tilsvarende position for musen TRPV3 R696 i TRP-boksen er også R (R701) i TRPV1, en konserveret lysin (K664) i TRPV2 og en uladet tryptofan (W737) i TRPV4 (Fig. 4A; Fig. S5A).