4-1BB/4-1BBL-Interaktion fördert Adipositas-induzierte Fettgewebsentzündung durch Auslösung bidirektionaler Entzündungssignale in Adipozyten/Makrophagen

Abstract

Die Adipositas-induzierte Fettgewebsentzündung ist durch die Rekrutierung von Makrophagen im Fettgewebe und die Freisetzung entzündlicher Zytokine gekennzeichnet. 4-1BB, ein kostimulatorischer Rezeptor, moduliert entzündliche Prozesse durch Interaktion mit seinem Liganden 4-1BBL auf Immunzelloberflächen. In dieser Studie untersuchten wir, ob eine 4-1BB/4-1BBL-Interaktion zwischen Adipozyten und Makrophagen an der durch Fettleibigkeit ausgelösten Fettgewebsentzündung beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass 4-1BB auf Adipozyten exprimiert wird und durch Adipositas-bezogene Faktoren hochreguliert wird, was auch die 4-1BBL-Expression auf Makrophagen verstärkt. 4-1BB- und/oder 4-1BBL-Agonisten aktivierten entzündliche Signalmoleküle (MAPK/IκBα und MAPK/Akt) in Adipozyten und Makrophagen und verstärkten die Freisetzung von Entzündungszytokinen (MCP-1, TNF-α und IL-6). Darüber hinaus verringerte die Unterbrechung der 4-1BB/4-1BBL-Interaktion die Freisetzung von Entzündungszytokinen aus Kontakt-Kokulturen von Adipozyten/Makrophagen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die 4-1BB/4-1BBL-vermittelte bidirektionale Signalübertragung in Adipozyten/Makrophagen die Entzündung der Fettgewebe fördert. 4-1BB und 4-1BBL könnten nützliche Ziele für den Schutz gegen die durch Fettleibigkeit verursachte Entzündung der Fettgewebe sein.

1. Einleitung

Fettleibigkeitsbedingte Entzündungen gelten als mögliche Ursache für Stoffwechselstörungen wie Insulinresistenz, Typ-2-Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Fettgewebe ist aktiv an fettleibigkeitsbedingten Entzündungen beteiligt, indem es Makrophagen und T-Zellen rekrutiert und entzündliche Zytokine freisetzt (monozytochemotaktisches Protein-1, MCP-1; Tumornekrosefaktor alpha, TNF-α; Interleukin-6, IL-6), die die Differenzierung der Fettzellen, den Stoffwechsel und lokale/systemische Entzündungsreaktionen modulieren und unerwünschte Stoffwechselstörungen verursachen. Interessanterweise haben neuere Studien gezeigt, dass die direkte Kontakt-Kokultur von Adipozyten und Makrophagen zu einer deutlich erhöhten Freisetzung von Entzündungszytokinen führt, was darauf hindeutet, dass die Interaktion zwischen Zelloberflächenmolekülen auf diesen Zellen für die Förderung ihrer Entzündungsreaktionen wichtig ist.

4-1BB (auch bekannt als CD137 und TNFRSF9) ist ein klassisches Beispiel für ein kostimulatorisches Molekül und ein bekannter Entzündungsrezeptor, der von aktivierten T-Zellen an Entzündungsherden exprimiert wird. Die Stimulierung von 4-1BB auf T-Zellen führt zu einer Zellexpansion, zur Produktion von Zytokinen und zur Entwicklung von zytolytischen Effektor-Funktionen. Der 4-1BB-Ligand (4-1BBL, auch bekannt als CD137L und TNFSF9) wird von den meisten Immun- und vielen Nicht-Immunzellen in hohem Maße exprimiert und kann umgekehrte Signale in Zellen wie Makrophagen empfangen und weiterleiten. Es gibt immer mehr Belege dafür, dass die bidirektionalen 4-1BB/4-1BBL-Interaktionen an der Zelloberfläche von Immunzellen bei der Auslösung und Modulation verschiedener Entzündungsreaktionen (z. B. rheumatoide Arthritis, autoimmune Myokarditis und hämatologische Malignome) eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus treten 4-1BB/4-1BBL-vermittelte Interaktionen auch zwischen Immun- und Nicht-Immunzellen auf, die wiederum Entzündungsreaktionen beeinflussen. So ist beispielsweise die Interaktion zwischen 4-1BB und 4-1BBL auf Endothelzellen und Makrophagen an der Gefäßentzündung beteiligt, und die Interaktion zwischen den beiden Molekülen auf Epithelzellen und natürlichen Killerzellen ist an der Ischämie-Reperfusionsverletzung der Nieren beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Expression von 4-1BB und 4-1BBL in Fettgewebe, das aufgrund von Fettleibigkeit entzündet war, hochreguliert war und dass die Ablation von 4-1BB die Entzündung des Fettgewebes reduzierte. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Interaktion zwischen 4-1BB und 4-1BBL auf Fettzellen und Immunzellen wie Makrophagen eine Rolle bei der Fettgewebsentzündung bei Fettleibigkeit spielt.

In dieser Studie zeigen wir zum ersten Mal, dass 4-1BB auf Adipozyten exprimiert wird und durch Adipositas-bezogene Faktoren hochreguliert wird, und wir zeigen, dass die 4-1BB/4-1BBL-vermittelte bidirektionale Signalübertragung in Adipozyten/Makrophagen eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Förderung der Adipositas-induzierten Entzündungskaskade spielt.

2. Materialien und Methoden

2.1. Tiere

C57BL/6-Mäuse (männlich, 8 Wochen alt) (Orient Ltd., Busan, Korea) wurden 9 Wochen lang mit einer fettreichen Diät (HFD, 60 % der Kalorien aus Fett (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); adipöse Mäuse) oder einer fettarmen Diät (LFD; 10 % der Kalorien aus Fett (Research Diets); nicht adipöse Mäuse) gefüttert. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Universität Ulsan genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health.

2.2. Antikörper

Nacktmäuse wurden mit Pristan geprimt und intraperitoneal mit einem subklonierten Hybridom injiziert, das einen agonistischen monoklonalen Antikörper (Ab) gegen 4-1BB (3E1) produziert, um die Aszitbildung zu induzieren. Der monoklonale Antikörper wurde durch Affinitätssäulenchromatographie mit Protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) aus der Aszitesflüssigkeit gereinigt. Rekombinantes 4-1BB Fc (r4-1BB Fc) wurde von Adipogen (Seoul, Korea) erworben. Antagonistischer monoklonaler Antikörper gegen 4-1BBL (TKS-1) wurde von e-Bioscience (San Diego, CA, USA) erworben. Ratten-Immunglobulin G (Ratten-IgG) und menschliches IgG1 wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft und als Kontrolle verwendet.

2.3. Zellkulturen und Behandlungen

Die murine Makrophagen-Zelllinie Raw264.7 wurde von der Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Seoul, Korea) bezogen. Diese Zelllinie wurde in RPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) mit 10% (vol/vol) FBS (fötales Rinderserum) (Gibco BRL, NY, USA) gehalten und bei 37°C in befeuchtetem 5% CO2 inkubiert. 3T3-L1-Präadipozyten wurden in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mit hohem Glukosegehalt (Gibco BRL, NY, USA) und 10 % FBS gehalten. Konfluente 3T3-L1-Präadipozyten (Tag 0) wurden 2 Tage lang in DMEM mit 10 μg/mL Insulin (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Dexamethason, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-Isobutyl-1-methyl-Xanthin, Sigma-Aldrich) und 10 % FBS inkubiert. 3T3-L1-Zellen wurden durch 2-tägige Inkubation in DMEM mit 10 % FBS und 5 μg/mL Insulin zu reifen Adipozyten differenziert. Die reifen Adipozyten wurden in diesem Medium gehalten, und das Kulturmedium wurde alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt. Freie Fettsäure (FFA, Palmitinsäuremischung, Sigma-Aldrich) wurde in Ethanol gelöst, das Rinderserumalbumin (BSA, 25 μM) enthielt, und vor der Verwendung mit BSA in einem molaren Verhältnis von 10:1 konjugiert. 3T3-L1-Adipozyten (3 × 105 Zellen/Vertiefung) oder Raw264.7-Makrophagen (3 × 105 Zellen/Vertiefung) in 24-Well-Platten wurden 24 Stunden bzw. 4 Stunden lang mit Adipositas-Faktoren (Palmitinsäure : pal, Lipopolysaccharid : LPS) behandelt. Zur Stimulierung von 4-1BB auf Adipozyten wurden 3T3-L1-Adipozyten in 24-Well-Platten 48 Stunden lang mit agonistischem 4-1BB-Ab (3E1, 1 μg/mL) oder Ratten-IgG in serumfreiem Medium inkubiert. Um r4-1BB Fc oder humanes IgG1 auf Kulturplatten zu immobilisieren, wurden r4-1BB Fc oder humanes IgG1 in 24-Well-Platten bei 37°C für 1 Stunde in einem CO2-Inkubator inkubiert und die Vertiefungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Anschließend wurden die Platten mit RPMI (10 % FBS) bei 37 °C für 1 Stunde in einem CO2-Inkubator inkubiert und die Vertiefungen mit PBS gespült. Rohe 264.7-Makrophagen wurden in einer Anzahl von 5 × 105 Zellen/Vertiefung in 24-Well-Flachbodenplatten, die mit 100 ng/mL r4-1BB Fc oder humanem IgG1 beschichtet waren, 24 Stunden lang inkubiert.

2.4. Isolierung stromaler vaskulärer Zellen aus Fettgewebe

Um die stromale vaskuläre Fraktion (SVF) aus Fettgewebe zu isolieren, wurden epididymiale Fettpolster von C57BL/6-Mäusen (männlich, 8 Wochen alt) zerkleinert und 30 Minuten lang bei 37°C mit Typ-2-Kollagenase (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) in DMEM (pH 7,4) verdaut. Die resultierenden Suspensionen wurden 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert und die Suspensionen 3 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Nach dem Waschen in DMEM wurden die Suspensionen durch sterile 100-μm-Nylonsiebe (SPL Lifescience, Pocheon, Korea) geleitet. Die filtrierten Zellen wurden in 100-mm2-Schalen übertragen, die DMEM mit 10 % FBS und 0,4 % Fungizone enthielten, und in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Die Zellen konnten sich anheften, und schwimmende Zellen wurden durch Absaugen entfernt, und das Kulturmedium wurde täglich aufgefüllt. Die SVF-Zellen wurden nach 2 Tagen entnommen. Die SVF-Zellen wurden mit 5 × 105 Zellen pro Vertiefung in 24-Well-Platten ausplattiert. Die konfluenten SVF-Präadipozyten wurden durch Behandlung mit DMEM, das 10 μg/mL Insulin (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (Sigma-Aldrich) und 10 % FBS enthielt, 2 Tage lang zu Adipozyten differenziert. Die reifen Adipozyten wurden in dem Kulturmedium gehalten, das alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt wurde. Zum Nachweis der 4-1BB- und 4-1BBL-Expression auf SVF-abgeleiteten Adipozyten, die adipösen Faktoren ausgesetzt waren, wurden diese Zellen 24 Stunden lang mit Palmitinsäure 250 μM und LPS 100 ng/mL inkubiert.

2.5. Isolierung von peritonealen Makrophagen

C57BL/6-Mäuse (männlich, 8 Wochen alt) wurden 4 Tage vor ihrer Tötung intraperitoneal mit 3 ml 3%iger Thioglykollatbrühe (Difco, Detroit, MI, USA) injiziert. Die peritonealen Makrophagen wurden durch Zentrifugation in MEM-Medium (Minimum Essential Medium, Gibco) gesammelt, das resultierende Pellet wurde gewaschen und in MEM-Kulturmedium mit 10% FBS resuspendiert. Die Peritonealmakrophagen wurden gereinigt, indem sie 2 Stunden lang an Gewebekulturplatten angeheftet wurden. Zum Nachweis der 4-1BB- und 4-1BBL-Expression auf Peritonealmakrophagen, die adipösen Faktoren ausgesetzt waren, wurden diese Zellen 4 Stunden lang mit Palmitinsäure 250 μM und LPS 100 ng/mL inkubiert.

2.6. Kokultur von Adipozyten und Makrophagen

3T3-L1 Adipozyten wurden kultiviert und 6 Tage lang differenziert. Die Kokultur von Adipozyten und Makrophagen wurde mit zwei Methoden durchgeführt: direkte Kontakt-Kokultur und Transwell-Kokultur. Im Direktkontaktsystem wurden Raw264.7-Makrophagen (3 × 105 Zellen: 50 % Makrophagen, 3 × 104 Zellen: 10 % Makrophagen) oder peritoneale Makrophagen (3 × 105 Zellen) in 24-Well-Platten mit 3T3-L1-Fettzellen (3 × 105 Zellen) platziert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang in Kontakt miteinander kultiviert und anschließend geerntet. Als Kontrolle wurden Adipozyten und Makrophagen auch separat kultiviert, wobei die Zellzahlen pro Vertiefung denen des Kontaktsystems entsprachen und nach der Ernte gemischt wurden. Im Trans-Well-System wurden die Zellen unter Verwendung von Trans-Well-Einsätzen mit einer 0,4 μm porösen Membran (Corning, NY, USA) kokultiviert, um Adipozyten (3 × 105 Zellen, untere Vertiefung) von Makrophagen (3 × 105 Zellen, obere Vertiefung) zu trennen. Nach einer Inkubationszeit von 4, 8 und 12 Stunden wurden die Überstände abgenommen.

2.7. Messung der Zytokinspiegel

Die Zytokinspiegel in den Kulturüberständen wurden mit Hilfe von Enzymimmunoassays (ELISA) gemessen. Die Tests wurden mit OptEIA-Maus-TNFα, einem Maus-MCP-1-Set (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) und einem Maus-IL-6- und Adiponectin-Set (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) sowie einem IL-10-Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) durchgeführt. Die Werte für die Zytokinwerte wurden aus Standardkurven unter Verwendung des Kurvenanpassungsprogramms SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) abgeleitet.

2.8. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

Die aus kultivierten Zellen extrahierte Gesamt-RNA wurde mit Hilfe von M-MLV Reverse Transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) zur Erzeugung von cDNA revers transkribiert. Die Echtzeit-PCR-Amplifikation der cDNA wurde in zweifacher Ausführung mit einem SYBR-Premix Ex Taq-Kit (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) unter Verwendung eines Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japan) durchgeführt. Alle Reaktionen wurden nach dem gleichen Verfahren durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 10 s, gefolgt von 45 Zyklen von 95°C für 5 s und 60°C für 30 s. Alle Werte für die interessierenden Gene wurden auf die Werte für Hauskeeping-Gene (36B4 für Adipozyten; β-Actin für Makrophagen und Kokulturen) normalisiert. Die verwendeten Maus-Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Daten wurden mit der Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.) analysiert. Relative Standardkurven wurden durch Auftragen der Zyklusschwellenwerte (Ct) erstellt. Auf der Grundlage der Ct-Werte jeder Probe wurden die relativen Mengen der Zielgene unter Verwendung der Standardkurven mit der von Takara Thermal Cycler Dice Real Time System bereitgestellten Software berechnet.

2.9. Trennung von Adipozyten und Makrophagen

Kokultivierte 3T3-L1-Adipozyten und Raw264.7-Makrophagen in gleicher Anzahl (wie zuvor beschrieben) wurden gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem CD11b MicroBeads System (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA) getrennt. Kurz gesagt: Die kokulturellen Zellen wurden gesammelt, zweimal mit Puffer (PBS mit 2 mM EDTA und 0,5 % Rinderserumalbumin-BSA) gewaschen und 15 Minuten lang bei 4 °C mit CD11b-Mikrobeads inkubiert. Die gewaschenen und resuspendierten Zellen wurden auf die MACS-Säule aufgetragen, die CD11b+ Zellen zurückhielt und negative Zellen (Adipozyten) passieren ließ. Die Säule wurde dann aus dem Separator entfernt und auf ein geeignetes Sammelröhrchen gesetzt. Geeignete Mengen an Säulenpuffer wurden auf die Säule pipettiert, um die positiven Zellen (Makrophagen) mit Hilfe eines mit der Säule gelieferten Stößels auszuspülen. Diese Methode führte zu 90 bis 95 % reinen CD11b+-Zellen, wie durchflusszytometrisch ausgewertet.

2.10. Durchflusszytometrie (FACS) Analyse

3T3-L1 Adipozyten und Raw264.7-Makrophagen, die mit Adipositas-bezogenen Faktoren behandelt wurden (wie zuvor beschrieben), wurden vorsichtig trypsinisiert, zweimal in PBS gewaschen und 10 Minuten lang auf Eis mit Fcγ-Rezeptor-blockierenden Antikörpern (24G2) inkubiert, dann mit Phycoerythrin (PE) konjugiertem Anti-4-1BB (eBioscience, San Diego, CA, USA), Anti-4-1BBL (eBioscience) oder Anti-Ratte (eBioscience), Goldener Syrischer Hamster IgG (eBioscience) und Anti-CD11b (eBioscience) als Kontrolle, um das Gate für Adipozyten/Makrophagen zu definieren. Die Zellen wurden dann mit FACS-Puffer gewaschen und auf einem FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) mit CellQuest-Software (BD Biosciences) analysiert. Die Zahlen in den Diagrammen geben den Prozentsatz der positiven Zellen an.

2.11. Western-Blot-Analyse

3T3-L1-Adipozyten wurden mit 1 × 106 Zellen/Vertiefung in 6-Well-Platten plattiert und 3 Stunden lang mit 3E1 (1 μg/mL) oder Ratten-IgG inkubiert. Raw264.7-Makrophagen wurden mit 1 × 106 Zellen/Vertiefung in 6-Well-Platten plattiert, die 1 Stunde lang mit r4-1BB Fc oder humanem IgG beschichtet waren. Die mit 3E1 behandelten Adipozyten und die mit r4-1BB Fc behandelten Makrophagen wurden mit PBS gespült, in Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5 % Deoxycholat, 1 % IGEPAL und Proteaseinhibitor-Cocktail) resuspendiert und 5 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Proben, die 10-30 μg Gesamtprotein enthielten, wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen, bei der polyklonale Antikörper gegen phosphorylierte IKK (I kappa B kinase alpha/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), gesamte IKKβ, p-p38 MAPK (mitogen-aktivierte Proteinkinase), p-JNK (c-Jun amino-terminale Kinase), gesamte JNK, p-Akt (Proteinkinase B; Ser473), Gesamt-Akt (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), und IκBα (Inhibitor des Nuklearfaktors-κB alpha; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), und β-Actin (Sigma).

2.12. Statistische Analyse

Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Doppelbestimmungen dargestellt. Statistische Vergleiche wurden mittels Student’s-Test oder ANOVA mit Duncan’s multiple-range test durchgeführt. Unterschiede wurden bei

3 als signifikant angesehen. Ergebnisse

3.1. Expression von 4-1BB und 4-1BBL in Adipozyten/Makrophagen und Fettgewebe

Wir haben zunächst die Expression von 4-1BB während der Adipogenese auf mRNA-Ebene mittels qRT-PCR gemessen. Wir stellten fest, dass die 4-1BB-Transkripte in SVF-abgeleiteten Adipozyten nach der Differenzierung höher waren (Abbildung 1(a)). Wichtig ist, dass adipositasbedingte Substanzen wie Palmitinsäure und LPS die 4-1BB-Transkripte in SVF-Fettzellen und die 4-1BBL-Transkripte in peritonealen Makrophagen signifikant hochregulierten (Abbildung 1(b)). Die Hochregulierung der Transkripte wird in 3T3-L1-Adipozyten und/oder Raw264.7-Makrophagen bestätigt (Abbildung 1(c)). Die FACS-Analyse ergab auch, dass das 4-1BB-Protein in 3T3-L1-Adipozyten und das 4-1BBL-Protein in Raw264.7-Makrophagen (Abbildung 1(d)) durch diese fettleibigkeitsbedingten Faktoren erhöht wurden. Darüber hinaus stiegen die 4-1BB- und 4-1BBL-Transkripte in kokultivierten Adipozyten/Makrophagen (Abbildung 1(e)) sowie im epididymalen Fettgewebe fettleibiger Mäuse, die mit HFD gefüttert wurden (Abbildung 1(f)).

3.2. Freisetzung entzündlicher Zytokine und Aktivierung entzündlicher Signalmoleküle durch 4-1BB- und 4-1BBL-Stimulation in Adipozyten bzw. Makrophagen

Um zu untersuchen, ob 4-1BB auf Adipozyten oder 4-1BBL auf Makrophagen ein Entzündungssignal liefert, haben wir jeden Zelltyp mit Agonisten behandelt, die diese Moleküle spezifisch stimulieren; 3T3-L1-Fettzellen wurden 48 Stunden lang mit einem agonistischen 4-1BB-Antikörper (3E1) behandelt, und Raw264.7-Makrophagen wurden 24 Stunden lang mit r4-1BB-Fc behandelt, und anschließend wurden die Konzentrationen entzündlicher Zytokine in den jeweiligen Zellen gemessen. Sowohl die 4-1BB-Stimulation von Adipozyten als auch die 4-1BBL-Stimulation von Makrophagen erhöhte die Produktion proinflammatorischer Zytokine wie MCP-1, TNF-α und IL-6 auf mRNA- (Abbildungen 2(a) und 2(c)) und Proteinebene (Abbildungen 2(b) und 2(d)) deutlich. Die Sekretion von Adiponektin aus Adipozyten wurde durch die Stimulation mit 4-1BB nicht verändert (Daten nicht gezeigt). Die 4-1BBL-Stimulation von Makrophagen verringerte die Transkripte von IL-10 (Abbildung 2(c)), aber es wurde keine Veränderung der IL-10-Proteinfreisetzung beobachtet (Abbildung 2(d)).

Abbildung 2

4-1BB- oder 4-1BBL-Stimulation steigert die Freisetzung verschiedener entzündlicher Zytokine aus Adipozyten oder Makrophagen. 3T3-L1-Adipozyten und Raw264.7-Makrophagen wurden 48-24 h lang mit 1 μg/mL 3E1 bzw. 100 ng/mL r4-1BB Fc behandelt. MCP-1-, TNF-α-, IL-6- und IL-10-Transkripte und -Proteine wurden dann in den 3T3-L1-Adipozyten (a-b) und Raw264.7-Makrophagen (c-d) gemessen. Die Phosphorylierung von IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt und β-Actin wurden durch Western Blotting gemessen. 3T3-L1-Adipozyten wurden 3 Stunden lang mit 1μg/mL 3E1 inkubiert (e) und Raw264.7-Makrophagen 1 Stunde lang mit 100 ng/mL r4-1BB Fc (f). Die Ergebnisse der Densitometrie wurden als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten, die in zweifacher Ausführung durchgeführt wurden. ; ; ; (im Vergleich zur Kontrolle).

Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, durch die 4-1BB und/oder 4-1BBL die Entzündungssignale in Adipozyten und/oder Makrophagen aktivieren, haben wir die Auswirkungen der 4-1BB/4-1BBL-Stimulation auf intrazelluläre Signalmoleküle untersucht. Die Stimulation von 4-1BB auf Adipozyten erhöhte die Phosphorylierung von p38 MAPK und JNK sowie die Phosphorylierung von IKK, dem Upstream-Molekül von NF-κB, und induzierte den Abbau von IκBα (Abbildung 2(e)), während die Stimulation von 4-1BBL die Phosphorylierung von Akt und p38 MAPK sowie von JNK (Abbildung 2(f)) erhöhte, aber keine Auswirkungen auf den Abbau des IκBα-Proteins (Abbildung 2(f)) und die Phosphorylierung von IKK hatte (Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit früheren Berichten aktivierte der 4-1BBL-Signalweg nicht nur p38 MAPK, sondern induzierte auch eine Akt-Aktivierung in Makrophagen, was zu einer erhöhten Expression entzündlicher Zytokine führte.

3.3. Freisetzung von Entzündungszytokinen in einem Kontakt-Kokultur-System

Da die Stimulation durch 4-1BB/4-1BBL die Freisetzung von Entzündungszytokinen aus Adipozyten bzw. Makrophagen verstärkte, untersuchten wir, ob die Zell-Zell-Interaktion über Oberflächenmoleküle, vermutlich 4-1BB/4-1BBL, eine Rolle bei der Initiierung und Auslösung von Entzündungsreaktionen spielt. Zunächst kokultivierten wir 3T3-L1-Adipozyten und Raw264.7-Makrophagen in einem direkten Kontaktsystem und stellten fest, dass die Produktion der Entzündungszytokine IL-6, MCP-1 und TNF-α mit der Anzahl der Makrophagen in der Kultur korreliert war (Abbildungen 3(a)-3(c)) und mit der Zeit zunahm (Abbildungen 3(d)-3(f)).

3.4. Wirkung der Unterbrechung der Interaktion zwischen 4-1BB und 4-1BBL auf die Freisetzung entzündlicher Zytokine in einem Kontakt-Kokultursystem

Um zu testen, ob die 4-1BB/4-1BBL-vermittelte Interaktion zwischen Adipozyten und Makrophagen an der Entzündungsreaktion in der Kontakt-Kokultur von 3T3-L1-Adipozyten/Raw264.7-Makrophagen beteiligt ist, blockierten wir die Interaktion mit einem neutralisierenden Antikörper (TKS-1). Der neutralisierende monoklonale Antikörper reagiert spezifisch mit 4-1BBL der Maus, wodurch 4-1BBL nicht an den 4-1BB-Rezeptor binden und die Interaktion zwischen 4-1BBL und 4-1BB unterbrechen kann. Daher kann sowohl das 4-1BB-vermittelte Signal in Adipozyten als auch das 4-1BBL-vermittelte Signal in Makrophagen durch die Behandlung mit TKS-1 abgeschwächt werden. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit TKS-1 die Spiegel von IL-6, MCP-1 und TNF-α mRNA in den in Kontakt kokultivierten Adipozyten/Makrophagen signifikant reduzierte (Abbildung 4(a)). Die Verringerung der Expression dieser entzündlichen Zytokine wurde auf Proteinebene bestätigt (Abbildung 4(b)). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Unterbrechung der Interaktion zwischen 4-1BB und 4-1BBL die Freisetzung von Entzündungszytokinen aus mit Adipozyten kokultivierten peritonealen Makrophagen reduzierte (Abbildung 4(c)). Um die relativen Beiträge der 4-1BB- und 4-1BB-Signalübertragung zur entzündlichen Genexpression in den kokultivierten Adipozyten/Makrophagen zu untersuchen, trennten wir die Makrophagen von den Adipozyten und maßen die Konzentrationen entzündlicher Zytokintranskripte in den beiden Zelltypen (Abbildung 4(d)). Der neutralisierende Antikörper verringerte den Anstieg der IL-6-, MCP-1- und TNF-α-mRNA sowohl in den Adipozyten als auch in den Makrophagen signifikant (Abbildungen 4(e) und 4(f)).

4. Diskussion

Die durch Adipositas ausgelöste Fettgewebsentzündung ist durch die Rekrutierung von Makrophagen in das Fettgewebe gekennzeichnet, und die Makrophagen sind eine wichtige Quelle für Entzündungsreaktionen. Der Zell-Zell-Kontakt zwischen Adipozyten und Makrophagen gilt als wichtig für die Auslösung von Entzündungsprozessen im Fettgewebe, obwohl unklar ist, welche Moleküle daran beteiligt sind. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Bindung des co-stimulatorischen Rezeptors 4-1BB mit seinem Liganden 4-1BBL durch Zell-Zell-Kontakt verschiedene Entzündungsreaktionen moduliert. In früheren Arbeiten haben wir festgestellt, dass ein Mangel an 4-1BB die Entzündung der Fettgewebe durch eine geringere Rekrutierung von Makrophagen und die Freisetzung von Entzündungszytokinen reduziert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse stellten wir die Hypothese auf, dass die 4-1BB/4-1BBL-vermittelte Zell-Zell-Interaktion zwischen Fettzellen und Makrophagen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und/oder Aufrechterhaltung der durch Fettleibigkeit ausgelösten Fettgewebsentzündung spielen könnte. Interessanterweise wurden die 4-1BB-Transkripte in Adipozyten und die 4-1BBL-Transkripte in Makrophagen durch Adipositas-bezogene Faktoren (z. B. FFA und LPS) deutlich hochreguliert, und ihre Expression war auch in Kontakt-Kokulturen von Adipozyten/Makrophagen stark erhöht. Darüber hinaus ging die Hochregulierung dieser Moleküle mit einer erhöhten Freisetzung von Entzündungszytokinen aus den Zellen einher. Diese Befunde sowie die Hochregulierung im adipösen Fettgewebe und die Verringerung der Fettentzündung bei 4-1BB-defizienten adipösen Mäusen deuten darauf hin, dass 4-1BB und 4-1BBL an der Entstehung und/oder Förderung von durch Fettzellen/Makrophagen ausgelösten Entzündungsreaktionen beteiligt sind.

Um herauszufinden, ob 4-1BB auf Adipozyten oder 4-1BBL auf Makrophagen für die Entzündungssignale verantwortlich ist, die die Entzündungsreaktionen auslösen, stimulierten wir die Zellen mit Agonisten, die spezifisch entweder an 4-1BB oder 4-1BBL binden. Wir stellten erstmals fest, dass die Stimulation von 4-1BB auf Adipozyten die Freisetzung der Entzündungszytokine MCP-1, TNF-α und IL-6 deutlich erhöhte. Die Stimulierung der 4-1BBL-vermittelten umgekehrten Signalübertragung, von der bekannt ist, dass sie Makrophagen aktiviert, führte ebenfalls zu einer erhöhten Freisetzung von Entzündungszytokinen. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die 4-1BB-Signalübertragung zur Aktivierung des MAPK/NF-κB-Signalwegs führt, der in Lymphozyten vom TNF-Rezeptor-assoziierten Faktor (TRAF)-2 abhängig ist. In Adipozyten haben wir festgestellt, dass die Stimulation von 4-1BB p38 MAPK, JNK und IKK aktiviert und den IκBα-Proteinabbau induziert. Andererseits führte die Stimulierung von 4-1BBL zur Aktivierung von Entzündungssignalmolekülen wie Akt und p38 MAPK in Makrophagen, was mit früheren Studien übereinstimmt. Noch wichtiger ist, dass die Behandlung mit einem neutralisierenden 4-1BBL-Antikörper die Freisetzung entzündlicher Zytokine in Kokulturen sowohl auf der mRNA- als auch auf der Proteinebene verringerte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die 4-1BB/4-1BBL-vermittelte Interaktion zwischen Fettzellen und Makrophagen bidirektionale Entzündungssignale auslöst und ein starker Auslöser von Entzündungsreaktionen im adipösen Fettgewebe ist (Abbildung 5).

Abbildung 5

Schematische Darstellung der bidirektionalen Signaltransduktion, die durch die 4-1BB/4-1BBL-vermittelte Interaktion zwischen Fettzellen und Makrophagen ausgelöst wird. Die Freisetzung von Entzündungszytokinen (MCP-1, TNF-α und IL-6) als Reaktion auf die bidirektionale Signalübertragung scheint an der Fettentzündung beteiligt zu sein.

Interessanterweise unterdrückte die Unterbrechung der 4-1BB/4-1BBL-Interaktion nicht vollständig die Freisetzung von Entzündungszytokinen aus kokultivierten Fettzellen und Makrophagen. Dies könnte auf das Vorhandensein anderer Zelloberflächenmoleküle zurückzuführen sein, die an Zell-Zell-Interaktionen beteiligt sind und Entzündungsreaktionen vermitteln. Tatsächlich exprimieren Adipozyten und Makrophagen viele Entzündungsrezeptoren und Liganden auf ihrer Oberfläche. So gelten beispielsweise CD40 und der Herpesvirus-Eintrittsmediator (HVEM), die auf Adipozyten exprimiert werden, als Vermittler der kontaktabhängigen Signalgebung von Makrophagen, und die Ablation dieser Rezeptoren verringert die durch Fettleibigkeit ausgelösten Entzündungsreaktionen. Daher ist es denkbar, dass neben 4-1BB und 4-1BBL auch andere Rezeptoren und Liganden an der Interaktion zwischen Adipozyten und Makrophagen beteiligt sind, die zur Auslösung und Aufrechterhaltung von Entzündungsreaktionen führt.

Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass die kontaktabhängige Interaktion zwischen Adipozyten und Makrophagen, die durch 4-1BB und 4-1BBL vermittelt wird und bidirektionale Signale erzeugt, eine entscheidende Rolle bei der Freisetzung von entzündlichen Zytokinen aus diesen Zellen in der Fettschicht spielt. 4-1BB und 4-1BBL könnten zusammen mit anderen Molekülen, die an der Zell-Zell-Interaktion zwischen Adipozyten und Makrophagen beteiligt sind, wertvolle Zielmoleküle zur Verhinderung der durch Fettleibigkeit verursachten Entzündung der Fettgewebe sein.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Dankeschön

Diese Arbeit wurde durch das Midcareer-Forschungsprogramm durch National Research Foundation (NRF) Grant KOSEF (2009-0079485), finanziert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST), und das Science Research Center Programm (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-0000643) des NRF von Korea, finanziert durch das MEST, unterstützt.