Chromosomen-Konformations-Capture (3C)-Methoden messen DNA-Kontakthäufigkeiten auf der Grundlage von Ligationen in Kernnähe, um genomische Faltmuster in vivo aufzudecken. 4C-seq ist ein Derivat der 3C-Methode, mit der das Genom nach Sequenzen durchsucht wird, die eine ausgewählte genomische Stelle von Interesse kontaktieren. 4C-seq verwendet inverse PCR und Sequenzierung der nächsten Generation zur Amplifikation, Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Fragmenten, die in der Nähe ligiert sind. Es erzeugt hochauflösende Kontaktprofile für ausgewählte genomische Stellen auf der Grundlage begrenzter Mengen von Sequenzierdaten. 4C-seq kann zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Genomorganisation eingesetzt werden. Sie dient in erster Linie der Identifizierung spezifischer langreichweitiger DNA-Kontakte zwischen einzelnen regulatorischen DNA-Modulen, die beispielsweise regulatorische Chromatinschleifen zwischen Enhancern und Promotoren oder architektonische Chromatinschleifen zwischen cohesin- und CTCF-assoziierten Domänengrenzen bilden. Darüber hinaus können 4C-seq-Kontaktprofile die Konturen von Kontaktdomänen aufzeigen und die strukturellen Domänen identifizieren, die dasselbe Kernkompartiment gemeinsam besetzen. Hier stellen wir ein verbessertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Probenvorbereitung und die Erzeugung von 4C-seq-Sequenzierungsbibliotheken vor, einschließlich einer optimierten PCR- und 4C-Template-Reinigungsstrategie. Darüber hinaus wird eine Datenverarbeitungspipeline bereitgestellt, die multiplexierte 4C-seq-Reads direkt aus FASTQ-Dateien verarbeitet und Dateien generiert, die mit Standard-Genombrowsern zur Visualisierung und weiteren statistischen Analyse der Daten kompatibel sind, wie z. B. Peak-Calling mit peakC. Die vorgestellten Protokolle und die Pipeline sollten es jedem ermöglichen, seine eigenen hochauflösenden 4C-Kontaktdatensätze zu erzeugen, zu visualisieren und zu interpretieren.