5-Hydroxymethylcytosin und seine potenzielle Rolle bei Entwicklung und Krebs

Doppelte Rolle von 5-Hydroxymethylcytosin als stabile DNA-Base und als Zwischenprodukt bei der DNA-Demethylierung

Wir wissen jetzt, dass die 5hmC-Konzentrationen zwischen verschiedenen Zelltypen und Geweben erheblich variieren und im Gehirn, insbesondere in Neuronen, am höchsten sind. Da 5hmC ein Oxidationsprodukt von 5mC ist, liegt es auf der Hand, dass die Bildung von 5hmC aus 5mC automatisch die 5mC-Konzentration an einer bestimmten Nukleotidposition oder sogar genomweit senkt. Daher war sofort klar, dass die Umwandlung von 5mC in 5hmC der erste Schritt in einem Weg sein könnte, der zur DNA-Demethylierung führt. Verschiedene experimentelle Systeme deuten darauf hin, dass dies tatsächlich der Fall sein könnte. Das Endergebnis dieses Demethylierungsweges ist die passive oder aktive Entfernung der modifizierten Base und/oder das Verschwinden der Methylgruppe von Cytosin in der DNA (Abbildung 1). Beim passiven Demethylierungsweg kann 5hmC nicht von der Erhaltungs-DNA-Methyltransferase DNMT1 kopiert werden, einem Enzym, das bereits vorhandene Methylierungsmuster weitergibt und auf hemimethylierte CpG-Stellen wirkt. Der aktive Demethylierungsprozess, der 5hmC als Zwischenprodukt verwendet, ist wesentlich komplizierter. Einem Bericht zufolge kann 5hmC durch DNA-Methyltransferasen in Cytosin umgewandelt werden. Bei der Desaminierung von 5hmC entsteht 5-Hydroxymethyluracil, das durch Enzyme zur Basen-Exzisionsreparatur wie Thymin-DNA-Glycosylase (TDG) und monofunktionelle Einzelstrang-Uracil-DNA-Glycosylase (SMUG1) entfernt werden kann. Wie effektiv ein solcher Weg in vivo funktioniert, ist derzeit jedoch unbekannt. Bei der schrittweisen Oxidation von 5hmC durch TET-Proteine entsteht 5-Formylcytosin (5fC) und anschließend 5-Carboxylcytosin (5caC) . Dieses 5caC, das in geringen Mengen in der DNA nachweisbar ist, kann dann entweder durch Basen-Exzisionsreparatur, die durch die DNA-Glycosylase-Aktivität des Proteins TDG katalysiert wird, oder durch Decarboxylierung entfernt werden. Theoretisch sollte der Decarboxylierungsweg vorteilhaft sein, da er keinen Bruch der DNA-Phosphodiesterbindungen erfordert, wie er bei der TDG-initiierten Basenausscheidungsreparatur auftritt. Bislang wurde jedoch keine enzymatische Aktivität für den Decarboxylierungsschritt identifiziert, obwohl die Decarboxylierung offenbar stattfindet.

Viele Gewebe akkumulieren beträchtliche Mengen an 5hmC, viel mehr als zu erwarten wäre, wenn diese Base nur ein vorübergehendes Zwischenprodukt in einem sequenziellen Oxidationsweg wäre, der zur DNA-Demethylierung führt. Daher könnte 5hmC ein epigenetisches Modul sein, das seine eigenen einzigartigen biochemischen Kodierungseigenschaften besitzt. Diese Funktion könnte eine negative oder abstoßende sein, da die Oxidation der Methylgruppe bei der Herstellung von 5hmC die Bindung von Proteinen blockiert, die ansonsten mit 5mC interagieren würden. Es kann aber auch eine positive oder instruktive Funktion sein, wenn es Proteine gibt, die spezifisch an 5hmC binden. Bislang haben mehrere verschiedene Proteine zumindest in vitro die Fähigkeit gezeigt, 5hmC zu erkennen, darunter UHRF1 , MBD3 , MeCP2 und mehrere andere, die durch einen Proteomik-Ansatz identifiziert wurden. Die biologische Rolle ihrer Bindung an 5hmC ist jedoch noch nicht ganz klar. Die meisten dieser Proteine haben auch andere Funktionen und sind daher möglicherweise nicht speziell für die Wechselwirkung mit 5hmC ausgelegt.

Die Rolle von 5-Hydroxymethylcytosin in der Entwicklung und Differenzierung von Säugetieren

Die funktionelle Rolle von 5hmC in Säugetiergenomen ist noch unklar. Zu Beginn des Lebenszyklus von Säugetieren, bei der Befruchtung der Eizellen durch Spermien, wird der größte Teil des 5mC im väterlichen (vom Sperma stammenden) Genom zu 5hmC oxidiert. Dieser Oxidationsschritt, von dem man bisher annahm, dass er eine echte DNA-„Demethylierung“ widerspiegelt, ist spezifisch für das väterliche Genom, während das mütterliche (von der Eizelle stammende) Genom vor der Tet-katalysierten Oxidation geschützt bleibt. Die Oxidation des väterlichen Genoms wird durch Tet3 katalysiert, das von dem einzigen Tet-Gen kodiert wird, das in Eizellen und Zygoten in erheblichem Umfang exprimiert wird. Der genetische Knockout von Tet3 bei Mäusen führt zu einer fehlgeschlagenen väterlichen Genom-Oxidation, einer beeinträchtigten Entwicklung und perinataler Letalität.

Ein weiterer wichtiger Entwicklungsschritt ist die globale DNA-Demethylierung in den primordialen Keimzellen (PGCs), die etwa am 8,5. bis 9,5. Die Mechanismen der Methylierungslöschung in PGCs sind weitgehend unklar und umstritten geblieben. Lange Zeit wurde angenommen, dass die replikationsunabhängige aktive DNA-Demethylierung ein Schlüsselweg ist, der wahrscheinlich an diesem Schritt beteiligt ist. Neuere Daten sprechen jedoch für einen passiven Methylierungsverlust, der durch fehlende Methylierungserhaltung während der DNA-Replikation verursacht wird. Dieser passive Verlust von 5mC kann durch die Umwandlung von 5mC in 5hmC ausgelöst werden. Tet1 und Tet2 sind die 5mC-Oxidasen, die in diesem Stadium am stärksten in PGCs exprimiert werden. Die Nachkommen von Mäusen mit Tet1- und Tet2-Mangel weisen Defizite bei der DNA-Demethylierung an geprägten Genen auf. Tet1/2-defiziente Tiere beider Geschlechter waren jedoch fruchtbar, wobei die weiblichen Tiere kleinere Eierstöcke und eine geringere Fruchtbarkeit aufwiesen. Die Deletion von Tet1 und Tet2 kann lebensfähige erwachsene Mäuse hervorbringen, obwohl die meisten dieser Mäuse während der Embryogenese oder um die Geburt herum sterben und verschiedene Entwicklungsstörungen aufweisen. Die Daten deuten darauf hin, dass die Tet1/2-induzierte 5mC-Oxidation in PGCs für die Erzeugung lebensfähiger Nachkommen nicht unbedingt erforderlich ist. Den derzeit verfügbaren Informationen über die DNA-Demethylierung in Zygoten und PGCs fehlt noch eine spezifischere Analyse von 5hmC auf DNA-Sequenzebene, wie sie z. B. durch TAB-Sequenzierung durchgeführt werden kann. Es wird erwartet, dass solche Informationen die globale oder ortsspezifische Beteiligung der 5hmC-Bildung an der Initiierung der passiven (oder aktiven) DNA-Demethylierung klären werden. Die frühere Beteiligung von Basen-Exzisionsreparaturprozessen an der Keimbahnreprogrammierung, die an sich schon ein enormes Risiko für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität darstellen würde, wenn sie auf globaler Ebene stattfände, könnte verschiedene andere Erklärungen haben. In einem Szenario könnte das Auftreten von Basenexzisionsreparaturaktivität durch die Notwendigkeit erklärt werden, unerwünschten, nicht zielgerichteten Oxidationsreaktionen entgegenzuwirken, die durch die Tet-Oxidase-Aktivität an Guaninen an methylierten CpG-Stellen katalysiert werden (Guanin ist die DNA-Base, die am anfälligsten für Oxidation ist). In einer anderen Umgebung kann 5hmC weiter oxidiert werden, vielleicht an spezifischen Sequenzen, durch Tet-Proteine, um 5caC zu bilden, das dann durch die von TDG initiierte Basen-Exzisionsreparatur entfernt wird.

Da 5hmC im Gehirngewebe am häufigsten vorkommt, ist es zu einer Priorität geworden, die Funktion dieser modifizierten Base im Gehirn zu verstehen. In der DNA der menschlichen Hirnrinde beispielsweise beträgt der Anteil von 5hmC etwa 1 % aller Cytosine oder 20 bis 25 % aller 5mC-Basen. Dies entspricht etwa 6.000.000 5hmC-Basen pro haploidem Genom. Diese Werte deuten eindeutig darauf hin, dass 5hmC eine wichtige funktionelle Rolle im Gehirn von Säugetieren spielt. Bisherige Studien haben gezeigt, dass 5hmC in Hirngeweben sehr häufig in Genregionen vorkommt, entweder an Promotoren oder noch häufiger in intragenischen Regionen, den so genannten Genkörpern . Es ist denkbar, dass die Bildung von 5hmC an Promotoren, CpG-Inseln oder CpG-Inselkanten analog zu einem Reparaturprozess funktioniert, um unangemessen eingeführte 5mCs in diesen Regionen zu oxidieren und schließlich zu entfernen. Die Ablagerung von 5hmC in Promotoren oder Genkörpern korreliert häufig positiv mit der Genaktivität. Der Mechanismus, wie das mit dem Genkörper verbundene 5hmC die Transkriptionsmengen erhöht, ist derzeit nicht bekannt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Oxidation von 5hmC eine repressive Wirkung auf die Transkription ausübt, vielleicht indem sie einer unerwünschten intragenischen Antisense-Transkription entgegenwirkt. Eine andere Erklärung könnte darin bestehen, dass 5hmC eine destabilisierende Wirkung auf die DNA-Struktur hat, die möglicherweise die Öffnung der Doppelhelix durch den Transkriptionsapparat begünstigt.

5hmC wird zwar von mehreren Methyl-CpG-bindenden Proteinen, darunter MBD1, MBD2 und MBD4, nicht erkannt, kann aber MeCP2 binden, ein Methyl-CpG-bindendes Protein, das im Gehirn reichlich vorhanden ist und bei der neurologischen Störung Rett-Syndrom mutiert ist. Frühere Studien, bei denen die Methyl-CpG-Bindungsdomäne (MBD) von MeCP2 und nicht das Protein in voller Länge verwendet wurde, kamen nicht zu dem Schluss, dass MeCP2 an 5hmC bindet. Die Gründe für diese Diskrepanzen sind nicht klar. Die Verbindung zwischen MeCP2 und 5hmC im Gehirn ist von besonderem Interesse, da die 5hmC-Konzentrationen im Gehirn am höchsten sind und MeCP2 ein reichlich vorhandenes Protein im Gehirn ist, das ähnliche Konzentrationen wie Histon H1 erreicht. Aus diesen Gründen kann davon ausgegangen werden, dass die Bindung von 5hmC durch MeCP2 im Gehirn eine genomweite und keine sequenzspezifische Rolle spielt.

Wie kürzlich gezeigt wurde, ist die Bildung von 5hmC für die Entwicklung des Gehirns entscheidend. Die Base ist in sich entwickelnden Neuronen reichlich vorhanden, in denen ihr Spiegel im Vergleich zu neuralen Vorläuferzellen ansteigt und wo sie spezifisch an Genkörpern von Genen lokalisiert ist, die für die neuronale Differenzierung wichtig sind. Tet3 wird in der sich entwickelnden Hirnrinde von Mäusen am stärksten exprimiert, gefolgt von Tet2, während die Konzentration von Tet1 in diesem Gewebe sehr gering ist. Ein Anstieg der Tet2-, Tet3- und 5hmC-Spiegel in sich differenzierenden Neuronen geht mit einer Verringerung der Polycomb-H3K27-Methyltransferase Ezh2 und einem Verlust von H3K27me3 bei kritischen Genen einher. Eine Verringerung der Spiegel von Tet2 und Tet3 oder eine Erhöhung der Ezh2-Expression führt zu einer unvollständigen oder blockierten neuronalen Differenzierung. Die Bildung von 5hmC fördert also die neuronale Differenzierung, indem sie die Expression von Genen moduliert, die für diesen wichtigen Entwicklungsübergang entscheidend sind.

Verlust von 5-Hydroxymethylcytosin bei Krebs

Die 5hmC-Konzentrationen bei Krebs sind im Vergleich zu dem den Tumor umgebenden Normalgewebe stark reduziert. Mit Hilfe von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie, Immuno-Dot-Blots auf der Basis von Anti-5hmC-Antikörpern und Immunhistochemie konnten wir den tumorassoziierten Verlust von 5hmC bei Lungen-, Gehirn-, Brust-, Leber-, Nieren-, Prostata-, Darm-, Gebärmutter- und Melanomkrebs nachweisen. Andere Forscher bestätigten diese Beobachtung, indem sie den Verlust von 5hmC bei verschiedenen Arten von soliden Tumoren nachwiesen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Wiedereinführung von TET2 den 5hmC-Spiegel wiederherstellt und das Metastasierungspotenzial von Melanomzellen verringert. Als wir Gewebeschnitte mit Antikörpern gegen 5hmC und gegen das Ki67-Antigen, einen Marker, der nur in proliferierenden Zellen zu finden ist, gemeinsam immunfärbten, stellten wir fest, dass 5hmC und Ki67 fast nie gleichzeitig in einer einzigen Zelle vorhanden sind. Auf klinisch-diagnostischer Ebene könnte die kombinierte immunhistochemische Analyse des 5hmC-Verlusts und des Vorhandenseins von Ki67-positiven Zellen zu einem Biomarker für die Krebsdiagnose entwickelt werden. Das Fehlen oder der starke Rückgang von 5hmC in Tumoren deutet darauf hin, dass proliferierende Zellen 5hmC verlieren. In den meisten Fällen ist die Tumormasse selbst dann 5hmC-arm, wenn Ki67-positive Zellen selten sind, was darauf hindeutet, dass diese Tumorzellen in der Vergangenheit proliferiert haben, was zu einem Verlust von 5hmC führte, der dann nicht wiederhergestellt wird. Der replikationsabhängige Verlust von 5hmC spiegelt eine Situation wider, die an die Situation bei Präimplantationsembryonen erinnert, bei denen auf die anfängliche Bildung von 5hmC in der väterlichen DNA ein replikationsabhängiger Verlust oder eine Verdünnung dieser Markierung folgt. In ähnlicher Weise nimmt der globale 5hmC-Gehalt rasch ab, wenn sich Zellen aus normalem Gewebe an die Zellkultur anpassen. Die einfachste Erklärung ist, dass die Oxidation von 5mC eine hemihydroxymethylierte CpG-Stelle in der DNA erzeugt, die von DNMT1 während der DNA-Replikation nicht erkannt wird. Eine solche Erklärung steht im Einklang mit In-vitro-Studien, die zeigen, dass DNMT1 nicht in der Lage ist, an CpG-Stellen zu arbeiten, die 5hmC enthalten. Es sind jedoch auch andere Erklärungen für den Rückgang von 5hmC bei Krebs möglich. Möglicherweise ist der Gehalt an TET-Proteinen im Tumorgewebe geringer als im entsprechenden Normalgewebe. Obwohl wir keine konsistenten Unterschiede auf RNA-Ebene für TET1, TET2 oder TET3 in Lungen- und Gehirntumoren im Vergleich zu normalem Gewebe feststellen konnten, haben andere Forscher über eine geringere TET-Genexpression bei Krebs berichtet. Eine weitere Möglichkeit ist, dass Krebszellen beeinträchtigte Stoffwechselwege aufweisen, die an der Produktion des Kofaktors für die TET-Aktivität, 2-Oxoglutarat, beteiligt sind (siehe unten).

Mutation von TET2 bei menschlichem Krebs

TET1 gehört zu einer Familie von Proteinen, die die Umwandlung von 5mC in 5hmC in der Säugetier-DNA fördern. Es gibt drei identifizierte Familienmitglieder, die zur TET-Familie gehören: TET1, TET2 und TET3. TET1 befindet sich auf dem menschlichen Chromosom 10q21.3, während TET2 auf Chromosom 4q24 und TET3 auf Chromosom 2p13.1 zu finden ist. Das TET1-Enzym besteht aus einer Zinkfinger-CXXC-DNA-Bindungsdomäne, einer cysteinreichen Region und einer 2-Oxoglutarat- und Eisen(II)-abhängigen Dioxygenase (2OGFeDO)-Domäne. TET3 enthält ebenfalls eine N-terminale CXXC-Domäne. Das TET2-Gen erfuhr jedoch während der Evolution eine chromosomale Geninversion, wodurch seine CXXC-Domäne von der katalytischen Domäne getrennt wurde und ein neues CXXC-Domänen-Gen namens IDAX/CXXC4 entstand, das für einen negativen Regulator von TET2 kodiert. Ausgehend von EST-Profilen und Expressionsarrays zeigt TET1 die stärkste Expression während der Embryogenese und keine relevante Expression in erwachsenen Geweben. TET2 wird hauptsächlich in hämatopoetischen Zellen exprimiert, und TET3 scheint in erwachsenen menschlichen Geweben ubiquitär exprimiert zu werden.

Leukämie ist eine Krankheit, bei der während der normalen hämatopoetischen Stammzelldifferenzierung die klonale Expansion der hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark in einem bestimmten Stadium der Differenzierung gestört ist, was zu einem Ungleichgewicht zwischen Differenzierung und Selbsterneuerung führt. Die unangemessene Expansion der hämatopoetischen Vorläuferzellen wird in erster Linie durch eine Blockade der Zellreifung verursacht. Myelodysplastisches Syndrom (MDS) Störungen der Hämatopoese sind gekennzeichnet durch Zytopenie (niedrige Blutzellzahl), ineffektive Hämatopoese in der einen oder anderen Zelllinie und ein erhöhtes Risiko der Umwandlung in akute myeloische Leukämie (AML) . Bei der AML führt das schnelle Wachstum abnormaler weißer Blutkörperchen im Knochenmark zu einer Blockade der Produktion verschiedener Zellen anderer Zelllinien.

TET2 wurde bei Patienten mit myeloproliferativen Neoplasmen (MPN), MDS, AML und chronischer myelomonozytärer Leukämie (CMML) mutiert gefunden und ist das am häufigsten mutierte Gen bei MDS. Mutationen von TET1 oder TET3 werden bei MDS nicht beobachtet, und die TET2-Mutation korreliert auch nicht mit mehreren anderen bekannten häufigen Mutationen. Interessanterweise werden Mutationen der Isocitrat-Dehydrogenase 1/2 (IDH1/2) selten zusammen mit TET2-Mutationen gefunden, haben aber ähnliche Auswirkungen wie TET2-Mutationen auf hämatopoetische Stammzellen (HSCs). Während TET2-Mutationen bei AML im Vergleich zu Patienten mit Wildtyp-TET2 mit einer verkürzten Gesamtüberlebenszeit assoziiert sind, begünstigen TET2-Mutationen bei MDS- und MPN-Patienten das Fortschreiten zur AML. Das TET2-Gen besteht aus insgesamt elf Exons, die in ein Proteinprodukt mit 2002 Aminosäuren übersetzt werden. TET2-Mutationen bei myeloischen Krebserkrankungen wurden am häufigsten in den Exons 3a und 10 beobachtet, die die längsten Exons sind. TET2-Mutationen bei MPN betreffen sowohl multipotente als auch fixe Vorläuferzellen der hämatopoetischen Linie, was darauf hindeutet, dass TET2 eine wichtige Rolle bei der Myelopoese spielt. Deletionen von TET2 und Verlust der Heterozygotie oder uni-parentale Disomie wurden bei (9 %) MDS/AML-Patienten mit mutiertem TET2 beobachtet, bei denen das Wildtyp-Allel wahrscheinlich während der Rekombination verloren geht, so dass das mutierte TET2 einen Funktionsverlust-Phänotyp fördert. Kosmider et al. beobachteten, dass 50 % der Patienten mit mutiertem TET2 genetische Defekte aufwiesen, die auf die beiden TET2-Kopien abzielten. Mutationen in TET2 scheinen zu einem Funktionsverlust zu führen, was darauf hindeutet, dass es eine tumorsuppressive Rolle spielen könnte.

Die zugrundeliegenden Implikationen des Funktionsverlusts von mutiertem TET2 und seine Rolle bei myeloischen Malignomen zu verstehen, ist eine aktuelle Priorität der Forschung. Mehrere Labors haben konditionale Tet2-Knockout-Mausmodelle entwickelt, bei denen kritische Tet2-Exons gezielt entfernt wurden. Moran-Crusio et al. beobachteten, dass Tet 2-/- Mäuse im Alter von 20 Wochen eine Splenomegalie entwickelten und ähnliche Phänotypen aufwiesen wie menschliche CMML-Patienten mit mutiertem TET2. Die Daten aus den verschiedenen Mausmodellen führten zu ähnlichen Beobachtungen. Die Deletion von Tet2 ist nicht embryonal tödlich. Eine wichtige Beobachtung von Moran-Crusio et al. und Ko et al. ist, dass hämatopoetische Stammzellen von Tet2-/- Mäusen eine erhöhte Fähigkeit haben, das hämatopoetische Kompartiment in vivo während kompetitiver Rekonstitutionsversuche mit Konkurrenz von HSCs aus Tet2+/+ Zellen zu besiedeln. Die Analyse verschiedener Organe von Tet2-/- Mäusen zeigte, dass der Verlust von Tet2 nicht durch einen Anstieg der Tet1- oder Tet3-Expression kompensiert wird. Der 5hmC-Spiegel ist im Knochenmark und in der Milz von Tet2-/- Mäusen signifikant erniedrigt. Tet2-/- Mäuse zeigen eine Zunahme der HSCs mit einer leichten Zunahme der myeloischen Vorläuferzellen, wodurch die Hämatopoese in Richtung Monozyten/Makrophagen-Zellschicksale verschoben wird. Es wird vermutet, dass ein aktives Tet2 die normale Hämatopoese regulieren würde, um eine korrekte Verteilung der Zelllinien und eine kontrollierte Differenzierung der HSZ zu gewährleisten. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen von TET2-Mutationen auf den Gehalt und die Muster von 5mC im Genom. Die derzeitige Datenlage ist jedoch alles andere als eindeutig. Während ein Bericht darauf hinweist, dass die TET2-Mutation bei AML mit einem Phänotyp der DNA-Hypermethylierung einhergeht, deuten andere Daten darauf hin, dass Knochenmarksproben von Patienten mit TET2-Mutationen niedrige 5hmC-Werte und eine DNA-Hypomethylierung aufweisen. Die Situation wird durch die Tatsache kompliziert, dass hämatopoetische Malignome häufig durch Mutationen in mehreren epigenetischen Modifikatoren wie EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A und ASXL1 gekennzeichnet sind, was möglicherweise jegliche eindeutige Assoziationen verwischt. So wiesen in einer Studie acht von elf Patienten mit DNMT3A-Mutationen (73 %) bei T-Zell-Lymphomen auch TET2-Mutationen auf.

Mutationen in Kofaktor-Wegen

5mC-Oxidasen sind 2-Oxoglutarat-abhängige Enzyme (Abbildung 2). Dieser Kofaktor wird im Tricarbonsäurezyklus aus Isocitrat durch das Enzym IDH hergestellt. Interessanterweise finden sich bei mehreren menschlichen Tumorarten Mutationen im IDH1-Gen. IDH1-Mutationen sind besonders häufig bei Gliomen des Grades II und III, wo sie bei bis zu 70 % der Patienten zu finden sind. Mutationen in IDH1 und IDH2 treten auch bei myeloischen Leukämien und einigen anderen bösartigen Erkrankungen auf, allerdings in geringerer Häufigkeit. Diese IDH1-Mutationen sind nicht über das gesamte Gen verstreut, sondern finden sich fast ausschließlich an der Aminosäureposition 132. Dieser Befund deutet darauf hin, dass dieses spezielle IDH1-Mutantenprotein die Eigenschaft eines Funktionsgewinns hat. Eine überraschende Entdeckung war, dass die IDH1-Codon 132-Arginin-Histidin-Mutante den Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat (2HG) als Reaktionsprodukt anstelle von 2-Oxoglutarat produziert. Es scheint, dass die von dieser Mutante durchgeführte Isocitrat-Oxidationsreaktion unvollständig ist und nur 2HG produziert. Außerdem ist 2HG ein kompetitiver Inhibitor vieler, wenn nicht aller 2-Oxoglutarat-abhängigen enzymatischen Aktivitäten. Die TET-Proteine stellen eine Klasse solcher Enzyme dar, und es wurde gezeigt, dass 2HG ein Inhibitor von TET1 und TET2 ist.

Ein interessantes Korrelat der IDH1-Mutation in Gliomtumoren ist, dass die IDH1-mutierten Tumoren fast immer mit umfangreichen genomweiten Veränderungen der DNA-Methylierung einhergehen, was durch eine weit verbreitete Hypermethylierung von CpG-Inseln angezeigt wird. Dieser Phänotyp wurde als CpG-Insel-Methylator-Phänotyp (oder CIMP) bezeichnet. Es liegt die Vermutung nahe, dass der CIMP bei IDH1-mutierten Gliomen mit einer fehlenden 5hmC-Produktion in diesen Tumoren zusammenhängt, da die TET-Aktivität durch 2HG beeinträchtigt wird. In der Tat führte die experimentelle Einführung eines IDH1-Mutantenkonstrukts in menschliche Astrozyten zum Auftreten eines CIMP-ähnlichen Phänotyps. Darüber hinaus wurde in konditionalen Knock-in-Mäusen, bei denen die häufigste Idh1-Mutante R132H in den endogenen Idh1-Lokus eingefügt und in hämatopoetischen Zellen exprimiert wurde, eine DNA-Hypermethylierung beobachtet. Bei einem direkten Vergleich der 5hmC-Werte in der DNA zwischen IDH1-Mutanten und IDH1-Wildtyp-Gliomen konnten wir jedoch keine wesentlichen Unterschiede zwischen diesen beiden Kategorien von Hirntumoren feststellen. Daher muss man bedenken, dass die IDH1-Mutation und ihr Stoffwechselprodukt 2HG nicht nur die TET-Enzyme beeinträchtigen, sondern auch viele Lysin-Demethylasen hemmen, die von 2-Oxoglutarat und anderen 2-Oxoglutarat-abhängigen Enzymen abhängen. Die Funktionsstörung dieser Lysin-Demethylasen kann sich sekundär auf die DNA-Methylierungsmuster an CpG-Inseln auswirken.