ABT-263: Ein potenter und oral bioverfügbarer Inhibitor der Bcl-2-Familie

Ergebnisse

ABT-263 ist ein oral bioverfügbarer Inhibitor der Bcl-2-Familie. Die strukturellen Merkmale von ABT-737, die ihm unerwünschte Arzneimitteleigenschaften verleihen, resultieren aus Designelementen, die für die Hemmung einer großen Oberfläche, einer hydrophoben Protein-Protein-Wechselwirkung und der Verringerung der Serumalbuminbindung wesentlich sind (4-6). Um die orale Wirksamkeit dieses relativ großen Moleküls (MW >800) zu verbessern, war ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen Zielaffinität, zellulärer Potenz und oraler Absorption erforderlich. Es wurden drei Schlüsselstellen entlang des Rückgrats von ABT-737 identifiziert, die das Ladungsgleichgewicht, den Metabolismus und die orale Absorption beeinflussen (Abb. 1). Analoga, die an diesen Stellen modifiziert wurden, wurden optimiert, um das pharmakokinetische/pharmakodynamische Verhältnis zwischen oraler Exposition in Tieren und Wirksamkeit in menschlichen Tumorzelllinien zu maximieren. Diese Bemühungen führten zur Identifizierung von ABT-263.

ABT-263 weist eine hohe Affinität für Bcl-xL, Bcl-2 und Bcl-w auf, die unter der Nachweisgrenze des Fluoreszenzpolarisationstests liegt (Ki ≤1 nmol/L), bindet aber schwächer an Mcl-1 und A1 (Tabelle 1). Dieses Selektivitätsmuster ähnelt dem seines Vorgängers ABT-737 und des BH3-only-Proteins Bad (12). Die subnanomolare Affinität von ABT-263 für Bcl-xL wurde durch einen empfindlicheren zeitaufgelösten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Assay bestätigt, der zeigt, dass das Enantiomer (ein Stereoisomer mit der entgegengesetzten Konfiguration der Morpholinoethyl-Gruppe, das als weniger aktive Kontrolle verwendet wird) ∼40-fach weniger wirksam ist.

Das pharmakokinetische Profil von ABT-263 zeichnet sich durch niedrige Plasma-Clearance-Werte und geringe Verteilungsvolumina bei Maus, Ratte, Hund und Affe aus, mit Plasma-Eliminationshalbwertszeiten nach i.v.-Dosierung von 4,6 bis 8,4 Stunden (ergänzende Tabelle S1). Die Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung betrug bei allen vier Spezies ∼20 %. Aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit zeigt ABT-263 eine verlängerte, durch die Auflösungsrate begrenzte orale Absorption. Die p.o.-Verabreichung in lipidbasierten Formulierungen, in denen der Wirkstoff deutlich besser löslich ist, führt zu einer verbesserten Absorption mit einer Bioverfügbarkeit von nahezu 50 % und einer oralen Eliminationshalbwertszeit von 8,9 Stunden bei Hunden. Eine repräsentative Plasmakonzentrationskurve nach i.v.- oder p.o.-Verabreichung bei Hunden ist in der ergänzenden Abb. S1 dargestellt.

ABT-263 zeigt eine mechanismusbasierte Zytotoxizität. Es wurde berichtet, dass eine Reihe von BH3-mimetischen kleinen Molekülen Mitglieder der Bcl-2-Familie mit bescheidener Affinität binden und Apoptose in Tumorzelllinien induzieren (21-23). Allerdings wurde kürzlich gezeigt, dass viele dieser Wirkstoffe Zellen unabhängig von Bax/Bak abtöten, was die funktionelle Relevanz ihrer schwachen Affinität zu Bcl-2-Proteinen und die tatsächlichen Wirkmechanismen dieser Moleküle in Frage stellt (14). Daher war es uns wichtig, eindeutig nachzuweisen, dass die durch ABT-263 induzierte Apoptose das direkte Ergebnis der Hemmung von Proteinen der Bcl-2-Familie ist. Zunächst wurde die zelluläre Aktivität von ABT-263 in der Interleukin-3 (IL-3)-abhängigen prolymphozytären FL5.12-Mauszelllinie untersucht. Der Entzug von IL-3 induziert die FL5.12-Apoptose, zum Teil durch Hochregulierung der proapoptotischen Faktoren Bim und Puma (24, 25). Die Überexpression von Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) oder Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) schützt vor den Auswirkungen des IL-3-Entzugs durch Sequestrierung von Bim und Puma (25). ABT-263, aber nicht das Enantiomer, hob den durch die Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL gewährten Schutz auf (EC50 = 60 bzw. 20 nmol/L; Abb. 2A). ABT-263 war unwirksam, wenn es darum ging, den Zelltod in Gegenwart von IL-3 auszulösen, wo FL5.12-Zellen keinen proapoptotischen Reizen ausgesetzt waren. Die Fähigkeit von ABT-263, FL5.12-Bcl-2- oder FL5.12-Bcl-xL-Zellen unter IL-3-Entzug abzutöten, wurde in Gegenwart des Caspase-Inhibitors ZVAD signifikant abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass die Zelltötung Caspase-abhängig ist (ergänzende Abb. S2).

Um festzustellen, ob die ABT-263-induzierte Zytotoxizität auf die Störung der intrazellulären Protein-Protein-Interaktionen der Bcl-2-Familie zurückzuführen ist, wurden Koimmunopräzipitationsstudien durchgeführt. ABT-263 induzierte eine dosisabhängige Abnahme der Bim:Bcl-xL-Interaktionen innerhalb von 2 Stunden nach der Behandlung in FL5.12-Bcl-xL-Zellen (ergänzende Abb. S3). Ähnliche Muster wurden auch bei der Unterbrechung von Bim:Bcl-2-Komplexen in FL5.12-Bcl-2-Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass ABT-263 den IL-3-abhängigen Zelltod wiederherstellt, indem es die Fähigkeit von Bcl-xL und Bcl-2, proapoptotische Faktoren wie Bim zu sequestrieren, abschwächt. Die Fähigkeit von ABT-263, die Protein-Protein-Interaktionen der Bcl-2-Familie zu stören, wurde in einem Säugetier-Two-Hybrid-System bestätigt (Abb. 2B). ABT-263 hemmte die Interaktion von VP16-Bcl-xS mit Gal4-Bcl-xL (scheinbare EC50 ∼50 nmol/L), wohingegen das Enantiomer deutlich weniger wirksam war.

Um den Wirkmechanismus weiter zu untersuchen, wurde die Aktivität von ABT-263 in einer Reihe von embryonalen Fibroblastenzellen der Maus (MEF) untersucht, die sowohl Wildtypzellen (WT) als auch Zellen mit einem Mangel an Bcl-x, Mcl-1 und Bax/Bak (DKO) enthielten. ABT-263 induzierte den Zelltod in Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L), aber nicht in Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) MEF-Zellen (ergänzende Abb. S4A). Dies bestätigt die Fähigkeit von ABT-263, Bcl-xL, aber nicht Mcl-1, in einem zellulären Kontext funktionell zu hemmen, und steht im Einklang mit früheren Beobachtungen mit ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). Das Enantiomer war in beiden Systemen unwirksam. ABT-263 war ebenfalls unwirksam (EC50 ≥10 μmol/L) bei der Abtötung von WT- oder DKO-MEF-Zellen, was mit früheren Berichten übereinstimmt (14). Im Gegensatz dazu induzierten Etoposid, ein allgemeiner zytotoxischer Wirkstoff, sowie zwei berichtete niedermolekulare BH3-Mimetika den Zelltod mit ähnlichen EC50-Werten bei allen vier MEF-Zelltypen, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen den Zelltod zumindest teilweise durch Bcl-2-Familie-unabhängige Mechanismen induzieren (Supplementary Fig. S4C).

Um die Fähigkeit von ABT-263 zur direkten Auslösung von Apoptose in einer menschlichen Tumorzelllinie zu bewerten, wurden die Bax-Translokation und die Freisetzung von Cytochrom c in der SCLC-Zelllinie H146 überwacht. Es hat sich gezeigt, dass H146 für sein Überleben von Bcl-2 abhängig ist (25). ABT-263 induzierte innerhalb von 2 Stunden nach der Behandlung einen dosisabhängigen Rückgang des zytosolischen Bax in Verbindung mit einem Anstieg des zytosolischen Cytochroms c (Abb. 2C-i). Das Enantiomer war nicht in der Lage, eine ähnliche Reaktion hervorzurufen. Die Aktivierung von Bax und die Freisetzung von Cytochrom c wurden durch Mikroskopie bestätigt (Abb. 2C-ii). Der Anti-Bax-Antikörper 6A7, der spezifisch die konformationell aktive Form von Bax erkennt, wurde zum Nachweis von aktiviertem Bax in H146-Zellen verwendet. In Übereinstimmung mit den Fraktionierungsstudien war die Behandlung mit ABT-263 mit einem erheblichen Anstieg des aktivierten Bax verbunden. Dies korrespondierte mit der Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytosol, was durch verringerte punktförmige Strukturen und eine verstärkte Färbung des Zytosols belegt wurde. ABT-263, aber nicht sein Enantiomer, induzierte auch einen zeitabhängigen Anstieg der Caspase-3-Aktivität, der nach 2 Stunden nachweisbar war und nach ∼6 Stunden seinen Höhepunkt erreichte (Abb. 2D). Dieser Effekt war konzentrationsabhängig, mit einer EC50 ∼100 nmol/L zum Zeitpunkt von 6 Stunden (Abb. 2D, Inset). Im Gegensatz dazu konnte Camptothecin, ein Topoisomerase-I-Inhibitor, von dem berichtet wird, dass er mitochondriale Apoptose und anschließende Caspase-Aktivierung auslöst (27, 28), erst nach 24 Stunden einen Anstieg der Caspase-3-Aktivität hervorrufen (Daten nicht gezeigt). Diese Daten deuten darauf hin, dass ABT-263 direkt auf die Hemmung von Bcl-2 und Bcl-xL einwirkt und proapoptotische Faktoren wie Bim freisetzt, um eine rasche Aktivierung des mitochondrialen apoptotischen Weges zu bewirken.

Um die Breite der zellulären Aktivität von ABT-263 zu bewerten, wurde ein Panel menschlicher Tumorzelllinien untersucht, das eine Reihe von Tumortypen abdeckt. In Übereinstimmung mit früheren Berichten über ABT-737 (12) zeigte ABT-263 als Einzelwirkstoff Aktivität bei SCLC und hämatologischen Malignomen, jedoch nicht bei der Mehrheit der anderen Tumorarten (Daten nicht gezeigt). Um die Aktivität in diesen empfindlichen Tumorarten genauer zu untersuchen, wurde ABT-263 in Panels von Zelllinien untersucht, die von SCLC (n = 22) und hämatologischen Malignomen (n = 23) stammen. In jedem Panel zeigte ABT-263 eine Reihe von Wirkungen, wobei 32 % (SCLC) und 48 % (hämatologische Erkrankungen) der Zelllinien hochempfindlich waren (EC50 <1 μmol/L; Abb. 3). Das Enantiomer war in diesen empfindlichen Zellen >20-mal weniger aktiv (ergänzende Tabelle S2).

Die orale Verabreichung von ABT-263 führt zur Rückbildung von SCLC- und ALL-Xenograft-Tumoren in vivo. Um diese Beobachtungen in vivo zu erweitern, wurde ABT-263 in Flanken-Xenograft-Modellen untersucht, die aus einigen der empfindlichen SCLC- und hämatologischen Zelllinien hergestellt wurden. Bei einmal täglicher p.o.-Gabe von 100 mg/kg an 21 aufeinanderfolgenden Tagen führte ABT-263 bei allen Tieren mit H889- (SCLC) oder RS4;11- (ALL)-Tumoren zu einem raschen und vollständigen Ansprechen des Tumors, das auch mehrere Wochen nach Ende der Behandlung anhielt (Abb. 4A). Eine ähnliche Behandlung von Mäusen mit H146 SCLC-Tumoren führte zu einer raschen Rückbildung, die bei 60 % der Tiere zu CR und bei 40 % zu PR führte (Abb. 4A). Ein allmählicher Rückfall des Tumors wurde in diesem Modell mehrere Wochen nach Ende der Behandlung beobachtet. Die Aktivität war im H146-Xenograft-Modell dosisabhängig. Die Behandlung mit ABT-263 in einer Dosierung von 50 mg/kg an 21 aufeinanderfolgenden Tagen führte bei 22 % der Tiere zu einer CR und bei 44 % zu einer PR, während 25 mg/kg eine statistisch signifikante, aber bescheidene Hemmung des Tumorwachstums bewirkte, ohne dass eine Rückbildung des Tumors beobachtet wurde. ABT-263 war in allen Dosierungen gut verträglich (<5% Gewichtsverlust).

Um die Exposition von ABT-263 mit der Antitumor-Wirksamkeit zu korrelieren, wurde eine Steady-State-Pharmakokinetik-Studie durchgeführt, bei der Mäusen, die keinen Tumor trugen, drei Tage lang einmal täglich eine Dosis p.o. verabreicht wurde und die Plasmakonzentrationen des Arzneimittels nach der dritten Dosis bestimmt wurden. Sowohl die Spitzenplasmakonzentration (Cmax) als auch die Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve (AUC) waren proportional zur Dosis und stiegen in etwa linear an (ergänzende Tabelle S3). Eine Dosis von 100 mg/kg, die eine Gesamtansprechrate von 100 % ergab (Gesamtansprechrate = CR + PR), ergab Cmax- und AUC-Werte von 7,7 μmol/L bzw. 90 μmol/L h. Die Exposition bei einer Dosis von 50 mg/kg, die eine Gesamtansprechrate von 66 % auslöste, betrug 5,4 μmol/L (Cmax) und 54 μmol/L h (AUC). Diese Daten deuten darauf hin, dass Spitzenplasmakonzentrationen von ABT-263 im Bereich von ∼5,4 bis 7,7 μmol/L hochwirksam sind.

ABT-263 verstärkt die Aktivität von Chemotherapeutika in vivo. Die In-vivo-Wirksamkeit von ABT-263 wurde in Kombination mit häufig verwendeten Therapeutika in mehreren aggressiven Modellen hämatologischer Malignome untersucht. ABT-263 und Rituximab wurden im DoHH2-B-Zell-Lymphom-Flanken-Xenotransplantationsmodell untersucht (Abb. 4B). Bei einer täglichen Gabe von 100 mg/kg p.o. über 17 Tage zeigte ABT-263 eine 44%ige Hemmung des Tumorwachstums. Eine Einzeldosis von 10 mg/kg Rituximab bewirkte eine 84%ige Hemmung des Tumorwachstums. Weder ABT-263 noch Rituximab allein erreichten eine anhaltende Tumorregression; die Kombination zeigte jedoch eine überlegene Wirkung und erreichte 70% CR und 10% PR. Diese Kombination führte auch zu einer signifikanten Verbesserung der Verzögerung des Tumorwachstums (>700%) im Vergleich zu Rituximab allein (300%).

Die Wirksamkeit von ABT-263 allein und in Kombination mit einem modifizierten R-CHOP-Schema wurde auch in einem GRANTA-519-Flanken-Xenograft-Modell des Mantelzell-Lymphoms untersucht (Abb. 4B). Die Verabreichung von ABT-263 in einer Dosierung von 100 mg/kg p.o. an 21 aufeinanderfolgenden Tagen führte zu einer Hemmung des Tumorwachstums um 40%. Im Vergleich dazu hemmte das R-CHOP-Schema das Tumorwachstum um 68 % bei 20 % CR. Die Kombination führte zu dramatischen Tumorregressionen und vollständigen Tumorreaktionen bei allen getesteten Tieren, wobei es bei vier von neun auswertbaren Tumoren keine Anzeichen für ein erneutes Tumorwachstum gab.

Schließlich untersuchten wir die Fähigkeit von ABT-263, die Wirkung der Chemotherapie in einem gegen ABT-263 resistenten Modell zu verstärken. Im OPM-2-Flanken-Xenograft-Modell des Multiplen Myeloms (in vitro EC50 = 6,7 μmol/L) hemmte ABT-263 in einer Dosierung von 100 mg/kg täglich über 21 Tage das Tumorwachstum nicht signifikant (Abb. 4B). Bortezomib in der maximal verträglichen Dosis (1 mg/kg i.v., täglich × 3) hemmte das Tumorwachstum um 70 %, wobei keine CR auftrat. ABT-263 verstärkte die Wirksamkeit von Bortezomib, wobei die Kombination zu einer 95 %igen Hemmung des Tumorwachstums und einer 40 %igen CR-Rate führte.

ABT-263 führt zu einer schnellen, aber reversiblen Thrombozytopenie. Wir haben kürzlich berichtet, dass ABT-737 bei Tieren eine schnelle und reversible Thrombozytopenie auslöst, die aus der Hemmung von Proteinen der Bcl-2-Familie und der Induktion von Apoptose in zirkulierenden Thrombozyten ohne Knochenmarktoxizität resultiert (29). Wie erwartet induziert ABT-263 auch eine Thrombozytopenie. Nach einer einmaligen p.o.-Dosis bei Hunden sank die Zahl der zirkulierenden Thrombozyten innerhalb von 2 Stunden mit einem Platelet-Nadir nach 6 Stunden und Anzeichen eines Rebounds innerhalb von 24 Stunden (Abb. 5A). Um die Auswirkungen einer verlängerten Verabreichung zu bestimmen, untersuchten wir die pharmakokinetische/pharmakodynamische Beziehung nach mehrfacher täglicher Verabreichung bei Hunden (Abb. 5B). ABT-263 wurde 6 Tage lang p.o. in einer Dosierung von 2 mg/kg/d verabreicht und dann für weitere 6 Tage auf 6 mg/kg/d erhöht. Die Thrombozytenzahl und die Plasmakonzentration des Arzneimittels wurden 6 Stunden nach der Behandlung bestimmt, um die wahrscheinlichen Platelet-Nadirs an den Tagen 1 bis 4 und 7 bis 11 zu erfassen. Bei einer Dosierung von 2 mg/kg sank die Thrombozytenzahl von einem Ausgangswert von ∼250.000/μL bis zur zweiten Dosis auf ∼125.000/μL und blieb danach bei den übrigen Dosen konstant. Die 6 Stunden nach der Behandlung (C6h) gemessene Plasmakonzentration des Arzneimittels blieb konstant bei Werten zwischen 3,6 und 4,2 μmol/L. Auf der Grundlage des pharmakokinetischen Profils von ABT-263 (ergänzende Abb. S1) ist die C6h etwa 2-mal niedriger als die Cmax, was darauf hindeutet, dass die Spitzenplasmakonzentrationen des Arzneimittels nach mehreren 2 mg/kg-Dosen ∼7 bis 8 μmol/L betragen. Diese Konzentrationen sind mit denen vergleichbar, die nach einer 100 mg/kg p.o.-Dosis bei Mäusen erreicht wurden. Als die Dosis von ABT-263 auf 6 mg/kg/d erhöht wurde, sank die Thrombozytenzahl bis zum zweiten Tag dieser höheren Dosis auf ∼50.000/μL und blieb während der gesamten Dauer der Studie relativ konstant. Die C6h-Werte in dieser Dosisstufe lagen zwischen 10,2 und 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). ABT-263 wurde in dieser Studie gut vertragen, es gab keine Sterblichkeitsrate oder unerwünschte klinische Symptome. Allerdings traten an der Stelle der Venenpunktion einige Hämatome auf, was auf Veränderungen der Hämostase hindeutet. Diese Daten deuten darauf hin, dass die wiederholte tägliche Verabreichung von ABT-263 in Konzentrationen, die sich in Mausmodellen als hochwirksam erwiesen haben, zu einer Verringerung der zirkulierenden Blutplättchen bei Hunden um ∼50 % führt. Darüber hinaus werden Plasmakonzentrationen, die um ein Vielfaches höher sind als der wirksame Wert, gut vertragen, wobei die zirkulierenden Thrombozytenzahlen auf ∼50.000/μL reduziert werden.