Acetylcholin wird aus Acetyl-Coenzym A und Cholin durch das Enzym Cholin-Acetyltransferase synthetisiert. Im Nervensystem kommt dieses Enzym vermutlich hauptsächlich im Zytoplasma der Nervenendigungen vor. Coenzym A wird in den Mitochondrien synthetisiert und gelangt nach dem Transport durch die Mitochondrienmembran in das Zytoplasma zur Cholin-Acetyltransferase. Das für die Acetylcholinproduktion verwendete Cholin wird nicht nur in der Leber synthetisiert, sondern auch über die Nahrung aufgenommen. In den Kapillarendothelzellen gibt es ein Trägersystem, das für den Transport von Cholin in seiner freien und seiner Phospholipidform ins Gehirn verantwortlich ist. Durch Hydrolyse von cholinhaltigen Phospholipiden kann auch Cholin freigesetzt werden, das in der Acetylcholinsynthese verwendet wird. Da die Cholin-Acetyltransferase durch die Konzentrationen von Acetyl-Coenzym A und Cholin, die schätzungsweise in der Nervenendigung vorhanden sind, nicht gesättigt wird, scheint die Geschwindigkeit der Acetylcholinsynthese von der Verfügbarkeit der Vorstufen abhängig zu sein. Die Enzymaktivität wird auch durch Produkthemmung reguliert; durch Bindung an eine allosterische Stelle der Cholin-Acetyltransferase hemmt Acetylcholin deren Aktivität. Darüber hinaus beeinflussen die Massenwirkung und die neuronale Aktivität die Geschwindigkeit der Acetylcholinbildung. Die kurzfristige Regulierung der Enzymaktivität erfolgt teilweise durch Phosphorylierung, die durch Proteinkinasen induziert wird. Es gibt keine sehr spezifischen und potenten Inhibitoren des Enzyms, und es ist zu beachten, dass eine pharmakologische Blockade dieses Schrittes (z.B. mit Naphthylvinylpyridin) im Lebenszyklus von Acetylcholin eine weniger tiefgreifende Wirkung auf den Transmitter hat als die Hemmung des Cholintransports.
Ein spezifischer Acetylcholintransporter mit niedriger Affinität ist für die Aufnahme des Transmitters aus dem Zytoplasma in Vesikel verantwortlich. Die Gene für die Cholin-Acetyltransferase und den vesikulären Acetylcholin-Transporter sind in einem einzigen Genlocus organisiert, und die Transkription der beiden Gene wird in der Regel gemeinsam reguliert. (±)-Vesamicol ist ein selektiver Inhibitor dieses Transporters, wobei L-(-)-Vesamicol stärker ist als D-(+)-Vesamicol. Einmal in Vesikel verpackt, wird Acetylcholin durch Exozytose stimulusinduziert freigesetzt. Mehrere starke Toxine beeinflussen die Freisetzung von Acetylcholin, insbesondere Botulinumtoxin, das die Freisetzung hemmt.
Neuronale Acetylcholinesterase inaktiviert sehr schnell den Großteil des im Gehirn freigesetzten Acetylcholins, obwohl die in Gliazellen enthaltene Butyrylcholinesterase einen kleinen Teil des Acetylcholins in der Synapse hydrolysieren kann. In der Peripherie ist Acetylcholinesterase in Muskeln vorhanden, die cholinerge Innervation erhalten, während Butyrylcholinesterase weiter verbreitet ist. Es sind eine Reihe reversibler (z. B. Physostigmin, BW284C51) und irreversibler (z. B. iso-OMPA) Hemmstoffe der Acetylcholinesterase bekannt, die eine Verlängerung der synaptischen Wirkung von Acetylcholin bewirken. Reversible Anticholinesterasen der zweiten Generation wie Donepezil, Rivastigmin (ENA 713), Eptastigmin und Galantamin (Galanthamin) werden zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit eingesetzt. Einige Cholinesterasen der zweiten Generation wurden wegen inakzeptabler Nebenwirkungen aus dem klinischen Einsatz genommen (z. B. Tacrin, Metrifonat). Irreversible Acetylcholinesterase-Hemmer werden als Insektizide und chemische Kampfstoffe eingesetzt. Cholin, das durch Acetylcholinesterase aus Acetylcholin freigesetzt wird, wird durch einen hochaffinen Transporter wieder in die cholinergen Terminals aufgenommen und für die Transmittersynthese wiederverwendet. Hemicholinium-3 hemmt den Cholintransport wirksam und reversibel, was zu einem starken Rückgang der Acetylcholinbildung führt. Im Gegensatz zu Hemicholinium-3 ist A-4 (ein Bis-4-Methylpiperidin-Analogon von HC-3) nach peripherer Verabreichung aktiv. Stickstoffsenf-Analoga von Cholin sind starke irreversible Inhibitoren der hochaffinen Cholinaufnahme.