Zusammenfassung
Die Ultrazentrifugation mit Saccharose-Dichtegradienten ist eine leistungsfähige Technik zur Fraktionierung von Makromolekülen wie DNA, RNA und Proteinen. Zu diesem Zweck wird eine Probe, die eine Mischung von Makromolekülen unterschiedlicher Größe enthält, auf der Oberfläche eines Gradienten geschichtet, dessen Dichte von oben nach unten linear zunimmt. Während der Zentrifugation sedimentieren die Makromoleküle unterschiedlicher Größe mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch den Gradienten. Die Sedimentationsgeschwindigkeit hängt neben der Zentrifugalkraft auch von der Größe, Form und Dichte der Makromoleküle sowie von der Dichte und Viskosität des Gradienten ab. Auf diese Weise werden die Makromoleküle nach ihrer Größe getrennt, wobei die größeren Moleküle nach unten sedimentieren und die leichteren in der Nähe des oberen Endes des Gradienten bleiben. Die Methode hat sich besonders bei der Größenfraktionierung großer DNA-Moleküle bewährt und wurde ausgiebig zur Messung der Induktion und Reparatur von DNA-Brüchen nach Exposition gegenüber klastogenen Faktoren eingesetzt. Hier beschreiben wir eine Anpassung dieser Methode, die für die Analyse von neu synthetisierter DNA, die während der DNA-Replikation gebildet wird, verwendet werden kann. Durch Größenanalyse der naszierenden DNA in alkalischen Saccharosegradienten können Veränderungen der Replikationsaktivität gemessen werden, nachdem die Zellen DNA-schädigenden Substanzen ausgesetzt wurden. Die Methode ist besonders nützlich, da sie eine Unterscheidung zwischen den durch DNA-Schäden verursachten Auswirkungen auf die Kettenverlängerung und die Replikoninitiierung ermöglicht, was für eine eingehende Analyse des Intra-S-Phasen-Kontrollpunkts unerlässlich ist. Diese Fähigkeit macht die Technik einzigartig und rechtfertigt ihre etwas arbeitsintensive Natur.