Assembly Principles Learned from In Vitro Studies
Funktionale bakterielle 30S und 50S ribosomale Untereinheiten können in vitro aus rRNA und jedem der ribosomalen Proteine rekonstruiert werden. Detaillierte Studien der biochemischen und biophysikalischen Prinzipien, die dem Ribosomenzusammenbau in vitro zugrunde liegen, haben nützliche Paradigmen für die Untersuchung der Ribosomenbiogenese in vivo geliefert.
Eines der ersten Prinzipien, das durch diese Experimente enthüllt wurde, ist, dass der Zusammenbau von r-Proteinen zu ribosomalen Untereinheiten in hierarchischer Weise erfolgt. Rekonstitutionsstudien bakterieller 30S ribosomaler Untereinheiten definierten eine „Montagekarte“ für die Reihenfolge der Assoziation der einzelnen r-Proteine mit rRNA. Je nach ihrer Reihenfolge in der Bindungshierarchie werden die r-Proteine als primär (direkte Bindung an rRNA), sekundär (Bindung ist abhängig von primären Bindungsproteinen) oder tertiär (Bindung ist abhängig von sekundären Bindungsproteinen) bezeichnet. Eine solche Abhängigkeitskarte hat sich zwar als sehr nützlicher Ausgangspunkt erwiesen, sie liefert jedoch keine Informationen über die Kinetik der Proteinbindung. Vielmehr spiegelt der Weg der Assemblierung weitgehend die Reihenfolge wider, in der jedes r-Protein am stabilsten mit der rRNA assoziiert ist. Darüber hinaus berücksichtigt die Assemblierungskarte weder den Faltungsweg der 16S rRNA unabhängig von r-Proteinen noch die Rolle der nukleolytischen Verarbeitung von rRNA-Vorläufern, die in vivo stattfindet, bei der Ribosomenassemblierung. In jüngerer Zeit wurden diese Aspekte des Aufbaus der 30S-Untereinheit mit Hilfe von Techniken wie der chemischen und der Hydroxylradikal-Sondierung der RNA-Konformation zur Untersuchung von Veränderungen der rRNP-Konformation im Laufe der Zeit und der Puls-Chase-Massenspektrometrie (PC/MS) zur Bestimmung der Kinetik der Bindung von r-Proteinen an rRNA genauer untersucht.
Eine mögliche Erklärung für die Beobachtung primär bindender r-Proteine in der Assembly Map ist, dass ihre Bindungsstellen zumindest teilweise durch die Konformation entstehen, die 16S rRNA unabhängig von r-Proteinen annimmt. Im Einklang mit dieser Idee und der Ansicht, dass sich Ribosomen aus einem RNA-Katalysator entwickelt haben, wurde gezeigt, dass sich die 5′-Domäne der 16S rRNA falten und tertiäre Kontakte in Abwesenheit aller r-Proteine bilden kann. Diese Tertiärstruktur ist in Abwesenheit von Proteinkontakten vermutlich nicht vollständig stabil und wird daher höchstwahrscheinlich durch die Bindung von r-Proteinen an Stellen stabilisiert, die durch vorübergehende Konformationen entstehen, die die rRNA bei ihrer Faltung annimmt. Daher legt das zweite Prinzip nahe, dass die Faltung der rRNA die Grundlage für die Bindung von r-Proteinen während des Ribosomenaufbaus bildet.
Ein drittes Prinzip, das sich aus In-vitro-Untersuchungen bakterieller Ribosomen ergeben hat, ist die Verstärkung der Bindung von r-Proteinen an die rRNA, wenn der Ribosomenaufbau fortschreitet. Viele r-Proteine kontaktieren mehrere Nukleotide der rRNA. Zeitaufgelöste Hydroxylradikal-Fußabdrücke haben gezeigt, dass einige dieser Nukleotide vor anderen geschützt werden, was darauf hindeutet, dass r-Proteine mit fortschreitender Ribosomenbiogenese mehr Kontakte mit rRNA herstellen und dadurch stabiler in die Ribosomen integriert werden.
Die anfängliche Herstellung einiger Kontakte zwischen r-Proteinen und rRNA stabilisiert möglicherweise bestimmte RNA-Konformationen und induziert Veränderungen in der rRNA-Konformation, um Bindungsstellen für zusätzliche (sekundäre oder tertiäre) r-Proteine zu schaffen. Die Bindung von r-Proteinen konsolidiert also die Faltungsgewinne der RNA und verleiht dem Assemblierungsprozess eine bestimmte Richtung. Dies legt ein Modell nahe, bei dem der Zusammenbau durch eine abwechselnde Reihe von RNA-Konformationsänderungen und Proteinbindungen erfolgt, die nacheinander die endgültige RNA-Struktur stabilisieren. Kinetische Daten haben gezeigt, dass der Zusammenbau der reifen 30S-Untereinheiten über mehrere, parallele RNA-Faltungswege erfolgt, die alle zum Endprodukt konvergieren. Dies hat zu dem Konzept einer Assemblierungslandschaft im Gegensatz zu einem einzigen Weg geführt, über den die Assemblierung der ribosomalen Untereinheiten erfolgt.
Schließlich haben In-vitro-Studien ergeben, dass die Ribosomen-Assemblierung in der 5′-nach-3′-Richtung erfolgt. PC/MS und chemische Untersuchungen der Sekundärstruktur von rRNA haben gezeigt, dass die Bindung von r-Protein an die 5′-Domäne von rRNA beobachtet werden kann, bevor Proteinkontakte mit der 3′-Domäne von rRNA hergestellt werden. Im Gegensatz dazu zeigten Hydroxylradikal-Fußabdrucktests einen anfänglichen Ausbruch des Nukleotidschutzes entlang der gesamten 16S-rRNA, was darauf hindeutet, dass die RNA-Faltung von vielen verschiedenen, über die RNA verteilten Stellen ausgeht und somit auf eine fehlende 5′-zu-3′-Richtung beim Zusammenbau hindeutet. Diese widersprüchlichen Beobachtungen lassen sich miteinander in Einklang bringen, wenn man die Art der verschiedenen Versuchsaufbauten berücksichtigt. Bei der PC/MS wird die Kinetik der Proteinbindung an rRNA gemessen, so dass nur stabile r-Protein-rRNA-Wechselwirkungen nachgewiesen werden können, da r-Proteine, die während des Pulses nur schwach binden, während der Verfolgung ausgewaschen werden können. Footprinting-Assays hingegen können den Nukleotidschutz sowohl durch schwach interagierende als auch durch stabil assoziierte r-Proteine erfassen. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass der Ribosomenzusammenbau zwar über die gesamte rRNA erfolgen kann, die endgültige enge Assoziation der r-Proteine mit der rRNA jedoch in 5′- zu 3′-Richtung stattfindet.
Es ist wichtig zu bedenken, wie diese In-vitro-Experimente den Zusammenbau in vivo widerspiegeln könnten oder nicht. Zum Beispiel ist der Ribosomenaufbau in vivo mit der Transkription von rRNA gekoppelt, was vermutlich auch zu der beobachteten 5′-nach-3′-Richtung der r-Protein-Assoziation beiträgt. rRNA könnte sich so entwickelt haben, dass sie sich bei ihrer Synthese von 5′ nach 3′ faltet und auf diese Weise r-Proteine einbaut, wodurch der Aufbau mit der Transkription von rRNA gekoppelt wird. Die Notwendigkeit eines Erhitzungsschritts während der Rekonstitution ribosomaler Untereinheiten in vitro und die Identifizierung einer Reihe bakterieller Mutanten, die bei der Produktion von Ribosomen defekt sind, deuten darauf hin, dass während der Ribosomenbiogenese in vivo trans-agierende Faktoren benötigt werden.