ORIGINAL PAPERS
Beschreibung eines weit verbreiteten Ausbruchs von aseptischer Meningitis durch das Echovirus 30 im Staat Rio de Janeiro, Brasilien
Vitor Laerte Pinto JuniorI; Maria Cristina RebeloII; Eliane Veiga da CostaIII; Edson Elias da SilvaIII; Márcio Neves BóiaIV
IDiretoria Regional de Brasília, Fiocruz, Brasília, DF
IILaboratório de Referência Estadual para Meningites, Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião, Rio de Janeiro, RJ
IIILaboratório de Enterovirus, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ
IVPós-graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ; Brasilien
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ABSTRACT
Das Echovirus 30 gehört zur Gattung der Enteroviren und wird häufig mit Ausbrüchen von aseptischer Meningitis (AM) in Verbindung gebracht. In Brasilien wurden Epidemien aufgrund dieses Serotyps in mehreren Bundesstaaten gemeldet, aber in Rio de Janeiro war er vor dieser Studie nur an sporadischen Episoden beteiligt. Wir haben retrospektiv Daten aus den AM-Meldebögen und der Enterovirus-Isolationsdatenbank des staatlichen Gesundheitsamtes von Rio de Janeiro (RJSHD) und des Enterovirus-Referenzlabors im Jahr 2005 gesammelt. In den Monaten März, April und Mai wurde ein Ausbruch von AM festgestellt, der mit einer hohen Zellkultur-Isolationsrate für das Echovirus 30 (17,4 %) einherging. Vor allem männliche Kinder im Alter von 1 bis 9 Jahren waren betroffen. Von den 22 Patienten mit bestätigter Echovirus-30-Erkrankung waren bei acht klinische Informationen verfügbar; Fieber, Kopfschmerzen und Erbrechen waren die häufigsten Symptome. Die Analyse des Liquors zeigte ein typisches Muster der Virusinfektion mit einem Median der Zellzahl von 100 Zellen/mm3 und einer Dominanz mononukleärer Zellen in 64,7 % der Fälle. Der Median der Protein- und Glukosespiegel lag bei 49 mg/dL und 56,5 mg/dL. Die Sterblichkeitsrate war gleich null. Trotz des gutartigen Verlaufs und des Mangels an Behandlungsmöglichkeiten ist die Überwachung der aseptischen Meningitis von entscheidender Bedeutung für die frühzeitige Identifizierung der Erreger von Ausbrüchen, wodurch zusätzliche Tests und ein unangemessener Einsatz von antimikrobiellen Mitteln vermieden werden können.
Schlüsselwörter: Aseptische Meningitis, Enterovirus, Echoviren, Zerebrospinalflüssigkeit.
Die aseptische Meningitis (AM) ist ein Syndrom, das durch das akute Auftreten von Fieber und Meningismus gekennzeichnet ist und bei dem die Analyse des Liquor cerebrospinalis (Liquor) typischerweise eine Dominanz mononukleärer Zellen und eine negative bakteriologische Untersuchung aufweist. Mit dem weit verbreiteten Einsatz von Virusimpfstoffen (vor allem gegen Polio, Mumps und Masern) sind Nicht-Polio-Enteroviren heute die Hauptursache für infektiöse AM, die sowohl für sporadische als auch für epidemische Fälle verantwortlich sind. Die Diagnose von Nicht-Polio-Enteroviren ist in Brasilien auf Forschungszentren beschränkt, in denen klinische Proben nur zu Zwecken der epidemiologischen Überwachung mittels Viruskultur oder PCR untersucht werden.
Echovirus 30 gehört zur Gattung der Enteroviren und wird hauptsächlich mit Fällen von AM mit epidemischem Muster in Verbindung gebracht. Die Inzidenz dieses Serotyps hat zugenommen, und in den letzten Jahren ist er einer der am häufigsten nachgewiesenen Enteroviren. In Brasilien wurde er bereits als Erreger von AM-Ausbrüchen in mehreren Bundesstaaten (Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Pernambuco und Pará) gemeldet, wobei häufiger ältere Kinder und Erwachsene betroffen sind und die Sterblichkeitsrate gering ist .
Zwischen März und Mai 2005 kam es im Großraum des Bundesstaates Rio de Janeiro zu einem Ausbruch von AM, der mit einer überdurchschnittlich hohen Zahl von bestätigten Isolierungen des Echovirus 30 aus Liquor und Kot von Patienten mit diesem Syndrom einherging. In dieser Studie wird über klinische, labortechnische und epidemiologische Daten berichtet.
Material und Methoden
Probanden
In dieser retrospektiven Studie wurden die epidemiologischen und demografischen Daten von 573 gemeldeten AM-Fällen im Jahr 2005 aus der Datenbank des Meningitis-Beratungsausschusses des Gesundheitsamtes des Bundesstaates Rio de Janeiro (RJSHD) überprüft und analysiert. Als AM wurden alle Fälle betrachtet, die folgende Kriterien erfüllten: Patienten jeden Alters mit Symptomen einer akuten Meningitis (Fieber, Kopfschmerzen, Erbrechen, Nackensteifigkeit und Reizbarkeit oder Lethargie) sowie ein Liquorprofil mit einer Anzahl weißer Blutkörperchen von > 10 Zellen/mm3 und einer negativen bakteriologischen Untersuchung.
Die klinischen Daten der Patienten, die im Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião (IEISS), Rio de Janeiro, behandelt wurden und bei denen eine Infektion mit dem Echovirus 30 bestätigt wurde, stammen aus den Krankenakten der Patienten und aus der Datenbank des Enterovirus-Referenzlabors. Es wurden Daten zu Alter, Geschlecht, Anzeichen und Symptomen, Komorbiditäten, anfänglichen Liquor-Analyseergebnissen und dem klinischen Ergebnis zum Zeitpunkt der Krankenhausentlassung erhoben.
Liquor-Analyse der klinischen Proben
Alle Patienten unterzogen sich einer Lumbalpunktion zur Beurteilung der Meningitis; kein Patient wurde diesem Verfahren nur zum Zweck der Probenentnahme für die Studie unterzogen. Der Liquor wurde auf Zellgehalt, Protein- und Glukosespiegel sowie bakteriologische Tests mit Hilfe von Routinemethoden des Labors untersucht.
Virusisolierung und -identifizierung
Alle Proben (Liquor und Fäkalextrakte von Patienten, die AM untersuchen) wurden in Volumina von 0,2 ml auf Zellkulturen zum Zweck der Virusisolierung beimpft. Die kontinuierlichen Zelllinien RD (humanes Rhabdomyosarkom) und HEp2 (humanes Kehlkopfkarzinom) wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, die meisten Enterovirus-Serotypen zu replizieren, ausgewählt. Die Röhrchen wurden sieben Tage lang bei 36 ºC aufbewahrt, einer Blindpassage unterzogen und weitere sieben Tage lang bei 36 ºC aufbewahrt. Zellkulturen, die einen zytopatischen Effekt (CPE) aufweisen, wurden bis zur weiteren Identifizierung bei -20 ºC aufbewahrt.
Proben, die einen für Enteroviren charakteristischen CPE aufwiesen, wurden einer RNA-Extraktion mit Trizol LS ® (Life Technologies) gemäß dem Herstellerprotokoll unterzogen. Die spezifische Enterovirus-Gruppen-RT-Polymerase-Kettenreaktion wurde mit einem Primerpaar (R-222 und F-292) durchgeführt, das ein 357 bp-Fragment innerhalb des Gens amplifiziert, das für das Hauptkapsidprotein VP1 kodiert, wie von Oberste et al. beschrieben. Nach 30 Zyklen Denaturierung bei 95ºC / 2“, Annealing bei 42ºC / 4“ und Extension bei 60ºC / 3“ in einem GeneAmp® PCR System 9700 Thermocycler (Applied Biosystems) wurden die Produkte durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,5 mg/mL) unter Verwendung einer 50 bp-Leiter (Invitrogen) als Molekulargewichtsmarker analysiert und in einem Transiluminator (UV-Licht) visualisiert. Spezifische Produkte wurden mit dem QIAquick® Gel Extraction“-Kit (Qiagen) gelgereinigt und anschließend durch Vergleich mit dem Molekulargewichtsmarker Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) in einem 1%igen Agarosegel quantifiziert.
Die Cycle-Sequencing-Reaktionen wurden mit der ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied-Biosystems) in einem GeneAmp®-Thermocycler mit Zyklen von 1“ bei 95ºC, 3“ bei 42ºC und 3′ bei 60ºC durchgeführt. Die mit beiden Primern (222 und 292) in Einzelreaktionen erhaltenen Sequenzprodukte wurden durch Isopropylalkohol-Fällung gereinigt und mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) analysiert. Die Serotypen der Enteroviren wurden durch Vergleich der Sequenzen mit denen in der GenBank mit Hilfe des Programms Blast ermittelt.
Erstellung von Endemie-Diagrammen und statistische Analyse
Alle Daten aus Patientenkarteien und aus dem RJSHD wurden mit Hilfe der SPSS-Statistiksoftware, Version 13.0 für Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.) eingefügt und analysiert. Es wurden deskriptive statistische Instrumente (Mittelwert, Median und Standardabweichung) verwendet. Die jährliche Inzidenz der aseptischen Meningitis wurde unter Verwendung der Bevölkerungsdaten aus der Schätzung des brasilianischen Instituts für Geographie und Statistik (IBGE) für 2007 als Nenner bewertet.
Für die Erstellung des AM-Endemie-Diagramms in Rio de Janeiro wurden die gemeldeten AM-Fälle zwischen den Jahren 2000 und 2004 analysiert. Der Mittelwert und die Standardabweichung der Häufigkeitsverteilung der Fälle für jeden Monat des Jahres wurden ermittelt, und dann wurde zu jedem Monatsmittelwert seine SD multipliziert mit 1,96 (z einer Normalverteilung mit 95 % Empfindlichkeit) addiert, um die Obergrenze des Diagramms zu konstruieren, die die Epidemieschwelle darstellt.
Ethik
Diese Studie wurde gemäß den brasilianischen Gesetzen über Forschung am Menschen geplant und von der Ethikkommission des Evandro Chagas Clinical Research Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, genehmigt.
Ergebnisse
Demographische und epidemiologische Daten
Im Jahr 2005 wurden im Bundesstaat Rio de Janeiro insgesamt 573 Fälle von aseptischer Meningitis gemeldet; die Inzidenz lag bei 3,71 Fällen/100.000 Einwohner. Die Daten zur Alters- und Geschlechtsverteilung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die meisten Fälle traten bei Kindern im Alter zwischen einem und neun Jahren auf; in dieser Altersgruppe waren 60,7 % der Fälle männlich und 39,3 % weiblich. Oberhalb dieser Altersgruppe wurde keine geschlechtsspezifische Dominanz beobachtet.
Fälle von AM traten während des gesamten untersuchten Zeitraums auf und konzentrierten sich auf die Metropolregion Rio de Janeiro. Die Häufigkeitsverteilung der AM-Fälle zeigt eine epidemische Periode zwischen den Monaten März und Mai (Abbildung 1). Die Anfangsphase der Epidemie begann im März mit 99 Fällen (erwartete 36 Fälle), der Höhepunkt wurde im April mit 122 Fällen (erwartete 38) erreicht und das Ende im Mai mit 58 Fällen (erwartete 39). In Brasilien entspricht dieser Zeitraum dem Ende des Sommers und dem Beginn des Herbstes.
Isolierung und Identifizierung von Enteroviren
Im Laufe des Jahres 2005 wurden 171 Liquor- und Kotproben von AM-Fällen auf Enteroviren untersucht, wobei die Zahl der zur Virusisolierung eingesandten Proben in diesem Zeitraum zwischen keinem und 85 pro Monat schwankte; von den 48 (28.Von den 48 isolierten Nicht-Polio-Enteroviren (28,0 % aller eingesandten Proben) wurde das Echovirus 30 in 17 Liquor- und 5 Kotproben (45,8 % der positiven Proben) nachgewiesen. Die Identifizierung dieses Erregers erfolgte ausschließlich in der Epidemiezeit, und die durchschnittliche Isolierungsrate lag bei 17,4 % (22/126). Nicht sequenzierte Nicht-Polio-Enteroviren wurden außerhalb des Ausbruchszeitraums in den anderen 26 (54,2 %) Liquorproben nachgewiesen (Abbildung 2).
Klinische Aspekte
Von den 22 Patienten mit bestätigter Echovirus-30-Erkrankung lagen bei acht klinische Daten und bei allen siebzehn Liquorproben Liquoranalyseergebnisse vor. Die Patienten waren überwiegend männlich (54,5 %) und zwischen 2 und 36 Jahre alt (Median 4,5 Jahre). Die häufigsten Symptome waren Kopfschmerzen (100,0%, 8/8), Fieber (87,5%, 7/8), Erbrechen (62,5%, 5/8) und Nackensteifigkeit (52,5%, 5/8). Die Liquoranalyse zeigte eine Pleozytose mit einem Medianwert von 100 Leukozyten/mm3 (32 bis 325 Leukozyten/mm3), wobei in 64,7 % (11/17) mononukleäre Zellen überwogen. Der Eiweißspiegel war mit einem Medianwert von 49 mg/dL (28 bis 84 mg/dL) und einem Medianwert von 56,5 mg/dL (43 bis 92 mg/dL) leicht erhöht. Die Sterblichkeitsrate war gleich null.
Diskussion
Unsere Studie berichtet über den ersten mit dem Echovirus 30 zusammenhängenden Ausbruch im Bundesstaat Rio de Janeiro, der sich im Jahr 2005 ereignete, und zeigt seine klinischen, labortechnischen und epidemiologischen Aspekte. Der Ausbruch begann im März, schritt bis Ende April fort und kehrte im Juni auf das endemische Niveau zurück.
Die aseptische Meningitis ist ein Syndrom mit einer breiten Liste möglicher ätiologischer Erreger und wird in Brasilien nur unzureichend erfasst; die Schwierigkeiten bei der Durchführung der ätiologischen Diagnose in der klinischen Praxis liegen bei uns in den hohen Testkosten und dem erforderlichen technischen Know-how. Dennoch haben mehrere Studien, die in den letzten 30 Jahren die Ätiologie der AM in verschiedenen Regionen der Welt untersucht haben, ergeben, dass Nicht-Polio-Enteroviren für die Mehrzahl der Fälle verantwortlich sind, wobei die Häufigkeit zwischen 52 % und 92 % liegt.
In unserer Studie zeigte die Geschlechts- und Altersverteilung der AM-Fälle ein ähnliches Muster, wie es in anderen Studien über durch Enteroviren verursachte Erkrankungen des Zentralnervensystems beschrieben wurde, mit einer männlichen Dominanz und einer Betroffenheit von Kindern im Alter von 1 bis 9 Jahren. Der Grund für das Überwiegen der Männer ist nicht bekannt, aber es wird vermutet, dass dieses Geschlecht den Risikofaktoren, die bei der Übertragung eine Rolle spielen, in höherem Maße ausgesetzt ist.
AM-Fälle in Gebieten mit gemäßigtem Klima haben Berichten zufolge eine saisonale Verteilung mit einer Spitze der Inzidenz im Sommer, wahrscheinlich in Verbindung mit der Zeit der Schulferien und Freizeitaktivitäten. In tropischen und subtropischen Gebieten sind die AM-Fälle gleichmäßig über das Jahr verteilt, wie aus dem in unserer Studie erstellten Endemiediagramm hervorgeht. In einer früheren Studie zeigten dos Santos et al. ein ähnliches Muster, aber es gab eine Tendenz zum Auftreten von Fällen in Perioden mit höheren Temperaturen.
Echovirus 30 tritt epidemisch auf, und AM ist das am häufigsten berichtete Syndrom. Dieser Serotyp war in den vergangenen Jahren für Ausbrüche von AM in mehreren brasilianischen Bundesstaaten (Paraná, Rio Grande do Sul, Pernambuco und Pará) verantwortlich, immer mit gutartigem klinischen Verlauf und Ergebnis. In anderen Regionen der Welt ist das Echovirus 30 bereits der am häufigsten aus dem Liquor von Patienten mit AM isolierte Serotyp, und Überwachungsdaten aus den Vereinigten Staaten deuten darauf hin, dass das Echovirus 30 große Ausbrüche verursacht hat, die von Ruhephasen unterbrochen wurden. Molekularepidemiologische Studien, die während der Ausbrüche durchgeführt wurden, wiesen fünf verschiedene Genotypen des Echovirus 30 nach, was die vorgeschlagene Erklärung für dieses epidemiologische Verhalten ist .
Im Bundesstaat Rio de Janeiro wurde die Verbreitung des Echovirus 30 in Verbindung mit sporadischen Fällen von AM seit 2001 gemeldet. Im Jahr 2005 wurde zwischen den Monaten März und Mai ein Anstieg der gemeldeten AM-Fälle über das für diesen Zeitraum geltende epidemische Niveau hinaus beobachtet. Gleichzeitig wurde das Echovirus 30 aus klinischen Proben isoliert, die an das Enterovirus-Labor geschickt wurden, und zwar in einem Anteil, der weit über dem liegt (17,4 %), der für sporadische Fälle als normal angesehen wird, d. h. weniger als 10 %. Diese hohe Isolierungsrate war mit derjenigen vergleichbar, die bei einem mit dem Echovirus 30 assoziierten Ausbruch in Taiwan im Jahr 2001 beschrieben wurde. Diese Fakten bestätigen das Auftreten eines Ausbruchs, der durch das Echovirus 30 verursacht wurde, zum ersten Mal in diesem Staat.
Klinisch beobachteten wir ein typisches Meningitis-Syndrom mit plötzlich einsetzendem Fieber und Kopfschmerzen als häufigste Manifestationen. Die Sterblichkeitsrate war bei den Patienten mit bestätigter Echovirus-30-Erkrankung gleich null, was den gutartigen Verlauf der Krankheit zeigt. Dennoch wäre eine prospektive neurologische Untersuchung dieser Fälle notwendig, um neurologische Langzeitfolgen auszuschließen.
Die in dieser Studie präsentierten Überwachungsdaten repräsentieren alle gemeldeten Fälle, einschließlich derer, die wahrscheinlich nicht durch Enteroviren verursacht wurden, da andere Erreger in unserem Land nicht selten sind, wie Leptospira sp., Dengue-Virus, Bartonella sp. und Herpes-simplex-Virus. Epidemiologische Daten über die ätiologischen Erreger der AM in Rio de Janeiro sind weitgehend unbekannt, so dass die Frage nach dem tatsächlichen Ausmaß der Beteiligung von Enteroviren an AM-Fällen in unserem Umfeld ungelöst ist. Ein weiterer wichtiger Aspekt, den wir bei diesem Ausbruch nicht beschreiben konnten, war die Art der Krankheitsübertragung; Enteroviren werden in der großen Mehrheit der Fälle durch fäkal-orale Kontamination erworben, was mit dem Kontakt mit einer gemeinsamen Quelle, wie Nahrung und Wasser, oder mit dem Kontakt von Mensch zu Mensch zusammenhängen könnte. Beide Mechanismen könnten für die Ausbreitung der Fälle in unserer Studie verantwortlich gewesen sein, aber die methodischen Einschränkungen durch das retrospektive Design ließen diese Analyse nicht zu.
Echovirus 30 wird mit Ausbrüchen von aseptischer Meningitis mit gutartigem Ausgang in Verbindung gebracht; es wird erwartet, dass die Häufigkeit dieses Serotyps in Brasilien zunimmt, was sich in großen Ausbrüchen von AM zwischen Perioden der Ruhe äußert. Die Intensivierung und Verbesserung der AM-Überwachung ist von entscheidender Bedeutung für die frühzeitige Identifizierung der Erreger von Ausbrüchen, wodurch zusätzliche Tests und der unnötige Einsatz von antimikrobiellen Mitteln vermieden werden können. Es sind weitere Studien erforderlich, um andere Erreger von AM in Brasilien zu ermitteln und ihre Übertragungsmechanismen zu klären.
Dankeschön
An Maria de Fátima Calderaro vom RJSDH für die Bereitstellung der epidemiologischen Überwachungsdaten.
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