Biosynthese von trans-4-Hydroxyprolin durch rekombinante Stämme von Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli

Konstruktion von trans-Hyp produzierenden rekombinanten Stämmen

Es gibt mehrere Gene in der Datenbank, die als mutmaßliche L-Prolin-4-Hydroxylase-Gene vermutet werden, darunter Gene in Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 und Dactylosporangium. sp. Mithilfe von PCR klonierten wir die mutmaßlichen P4H-Gene von P. stutzer und B. bronchiseptica RB50 und erhielten sie als p4hP und p4hB. Nach dem Verdau wurden sie an die entsprechenden Plasmide ligiert und in C. glutamicum bzw. E. coli übertragen. Die Länge von p4hP betrug 918 bps und die von p4hB 924 bps. Diese Sequenzen waren zu 100 % identisch mit den im NCBI veröffentlichten Genen. Das Gen von trans-P4H aus Dactylosporangium sp. (p4hD) wurde erfolgreich in E. coli exprimiert und kann L-Prolin mit guten enzymatischen Eigenschaften umwandeln. Die Länge von p4hD betrug 816 bps, die für ein Polypeptid mit 272 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 29.715 Dalton kodieren. In dieser Studie wurde p4hD mit einigen Änderungen an den Kernbasen verwendet. Die ursprüngliche Gensequenz von p4hD wurde analysiert (http://www.kazusa.or.jp/codon/), und die Ergebnisse zeigten, dass es sowohl bei C. glutamicum als auch bei E. coli einige seltene Codons gibt. Es wurde berichtet, dass seltene Codons stark mit einer geringen Proteinexpression verbunden sind. Es hat sich gezeigt, dass eine Codon-Optimierung für die heterologe Proteinexpression die Proteinexpression oft drastisch erhöht. Daher wurden die seltenen Codons des p4hD-Gens durch solche ersetzt, die in C. glutamicum sehr häufig verwendet werden, und der GC-Gehalt wurde durch synonyme Umwandlung von 73 % auf 61 % angepasst, was dem von C. glutamicum nahe kommt. Das modifizierte Gen von p4hD wurde entsprechend den oben genannten Modifikationen synthetisiert (Additional file 1).

Die Expression von P4H ist einer der wichtigen Aspekte beim Aufbau des trans-Hyp-Biosynthesewegs. Abbildung 2 zeigt die SDS-PAGE der in rekombinantem C. glutamicum und E. coli exprimierten trans-P4Hs. Alle rekombinanten trans-P4Hs wurden als lösliche Proteine ohne Einschlusskörper exprimiert. Es war offensichtlich, dass die rekombinanten trans-P4Hs in E. coli viel stärker exprimiert wurden als in C. glutamicum (Abbildung 2). Viele Faktoren haben Einfluss auf die Expression von Fremdproteinen, darunter Promotoren, das Wirts-Vektor-System und kulturelle Bedingungen usw. . Da es sich um die erste Expression von trans-P4Hs in C. glutamicum handelt, werden wir in unserer zukünftigen Arbeit umfassendere Studien wie die Auswahl von Promotoren und die Optimierung der Kulturbedingungen in Betracht ziehen.

Vergleich der P4H-Aktivitäten

Oxygenasen sind in der Industrie weit verbreitet, da sie die hochspezifische Oxyfunktionalisierung von nicht aktivierten C-H-Bindungen unter milden Bedingungen katalysieren können, insbesondere die Übertragung von molekularem Sauerstoff auf ein Substrat. P4H gehört zu einer Familie von 2-Oxosäure-abhängigen Dioxygenasen, die ein monomeres Protein sind und eher monomere als polymere Substrate nutzen. In dieser Studie wurden die Aktivitäten von trans-P4Hs mit rekombinanten ganzen Zellen gemessen (Tabelle 1). Unsere Daten zeigten, dass der exprimierte Proteingehalt und die enzymatische Aktivität bei 30°C höher waren. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Plasmide sehr stabil waren, da die Plasmidstabilitäten der rekombinanten E. coli- und C. glutamicum-Stämme am Ende der Fermentation alle mehr als 98 % betrugen.

Die rekombinanten Zellen, die verschiedene Gene exprimieren, zeigten unterschiedliche katalytische Aktivitäten gegenüber L-Prolin. Die Aktivität von trans-P4H, das von E. coli BL21/ pET28a-p4hD exprimiert wurde, war die höchste unter allen konstruierten rekombinanten Stämmen. Die neu klonierten und exprimierten Gene von P. stutzeri und B. bronchiseptica zeigten ebenfalls interessante Aktivitäten. Bei den verschiedenen Wirtsstämmen schnitt E. coli besser ab als C. glutamicum, was möglicherweise mit der Leistungsfähigkeit des entsprechenden Plasmids zusammenhängt. Vier L-Prolin produzierende Stämme von C. glutamicum wurden als Expressionswirtsstämme verwendet, und die resultierenden rekombinanten Stämme zeigten unterschiedliche enzymatische Aktivitäten. Die höchste spezifische enzymatische Aktivität unter den C. glutamicum-Stämmen wurde mit 40,7 U/mg – feuchte Zelle von C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB erreicht. Die spezifische enzymatische Aktivität von rekombinantem E. coli/pET28a -p4hD betrug jedoch bis zu 60,4 U/mg – Nasszelle. Das Wachstum der drei rekombinanten E. coli-Stämme war ähnlich. Es gab jedoch signifikante Unterschiede zwischen den rekombinanten C. glutamicum-Stämmen. Die rekombinanten C. glutamicum-Stämme mit höherer spezifischer Enzymaktivität wuchsen weniger als die mit geringerer spezifischer Enzymaktivität. Außerdem war die enzymatische Aktivität von E. coli BL21 /pET28a -p4hD ähnlich wie die von E. coli W1485/pWFH1 und höher als die von E. coli BL21/pET24-p4h1. p4hD in E. coli W1485/pWFH1 war das ursprüngliche p4hD in Dactylosporangium sp. während p4hD in E. coli BL21/pET24-p4h1 modifiziert wurde. Obwohl die Codon-Optimierung in dieser Studie für C. glutamicum entwickelt wurde, zeigten die Ergebnisse, dass sie auch in E. coli erfolgreich war.

Trans-Hyp-Produktion in Kolben

Die Produktion von trans-Hyp durch verschiedene rekombinante C. glutamicum- und E. coli-Stämme ist ebenfalls in Tabelle 1 dargestellt. Die Ausbeute an trans-Hyp durch diese rekombinanten Stämme hing sowohl von der enzymatischen Aktivität von P4H als auch vom Zellwachstum ab. E. coli BL21/ pET28a-p4hD hatte die höchste Ausbeute, was mit seiner spezifischen enzymatischen Aktivität zusammenhing. Obwohl die rekombinanten E. coli-Stämme im Produktionsmedium ähnlich wuchsen, gab es signifikante Unterschiede in der Produktion von trans-Hyp, die nicht mit den spezifischen enzymatischen Aktivitäten übereinstimmte. Die Produktion von trans-Hyp durch rekombinante C. glutamicum-Stämme war auch viel geringer als die von E. coli BL21/pET28a-p4hD. Dies war sowohl auf die geringere Expression von trans-P4H als auch auf das geringere Zellwachstum in C. glutamicum zurückzuführen. Die L-Prolin-Produktion der vier C. glutamicum-Stämme betrug ebenfalls weniger als 1 g/L. Zwischen den rekombinanten Stämmen von C. glutamicum mit demselben Gen p4hD gab es kaum Unterschiede in der trans-Hyp-Produktion, obwohl einige Stämme eine bessere enzymatische Leistung und Prolinproduktion aufwiesen.

Die Verwendung der rekombinanten Stämme zur direkten Synthese von trans-Hyp aus Glukose durch Fermentation war möglich, da sowohl die Enzyme als auch die für den Prozess benötigten Vorstufen verfügbar waren. Die überexprimierten fremden trans-P4Hs katalysierten die Hydroxylierung von L-Prolin an der trans-4-Position, während 2-Ketoglutarat von Glukose über den TCA-Zyklus zugeführt und dann oxidativ zu Succinat decarboxyliert wurde (Abbildung 1). Es wurde berichtet, dass Prolin bei der Produktion von Hyp durch rekombinante E. coli nur mit dem p4h-Gen benötigt wurde. Der Kohlenstoff in Prolin, der während der Fermentation zugesetzt wurde, floss nur in Aminosäuren, die aus Zwischenprodukten des TCA-Zyklus synthetisiert wurden, und nicht in die Gluconeogenese. Allerdings war die Hyp-Akkumulation in dieser Studie auch ohne die Zugabe von Prolin relativ hoch. Dies deutet darauf hin, dass Corynebacterium über einen leistungsfähigen Biosyntheseweg für Prolin verfügt. Der Biosyntheseweg von Prolin wurde auch in E. coli identifiziert, was zur Synthese von trans-Hyp durch rekombinante E. coli-Stämme beitragen könnte. Die Veränderung des Prolin-Synthesewegs in E. coli erhöhte die Ausbeute an Hyp, während die Bildung von Hyp auch die Rückkopplungshemmung von Prolin aufheben kann. Die Menge an Prolin (0-4 mM) förderte die Produktion von trans-Hyp. Eine kontinuierliche Zugabe von L-Prolin verbesserte die Produktionsausbeute jedoch nicht signifikant (Tabelle 2). In dieser Studie war die Kultivierungszeit deutlich kürzer als in der Literatur angegeben, was auf die verschiedenen verwendeten Medien zurückzuführen sein könnte und auf ein großes Optimierungspotenzial hinweist. Tatsächlich wurden 2,28 g/l trans-Hyp von rekombinanten E. coli ohne Zugabe von L-Prolin in Flaschen mit einer kleinen Modifikation des Mediums produziert und 6,72 g/l wurden durch Zugabe von nur 4 mM L-Prolin erreicht.

Um die Biosynthese von trans-Hyp durch rekombinantes C. glutamicum und E. coli weiter zu steigern, sollten auch alternative Ansätze in Betracht gezogen werden. In E. coli sollte der Abbau von Prolin überwunden werden. Obwohl die trans-Hyp-Produktion durch eine putA-Mutante von E. coli nicht weiter verbessert wurde, konnte die Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Prolin deutlich gesteigert werden. Sowohl in C. glutamicum als auch in E. coli ist die Expression von rekombinantem P4H als eine der Oxygenasen am physiologischen Stoffwechsel der Wirtszellen beteiligt, einschließlich Cofaktor, Co-Substrat und Sauerstoff. Ohne einen leistungsfähigen Prolin-Syntheseweg in E. coli wird die Verfügbarkeit und der Transport des Substrats die Transformation erheblich einschränken.