Charakterisierung einer pathogenen Variante im ABCD1-Gen durch molekulare Modellierung von Proteinen

Abstract

Hintergrund. Das ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1) Protein ist ein peroxisomaler Halbtransporter, der den Abbau von sehr langkettigen Fettsäuren (VLCFA) ermöglicht. Pathogene Varianten von ABCD1 führen dazu, dass sich VLCFAs in verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten anreichern, was zu einer Erkrankung namens X-chromosomale Adrenoleukodystrophie (X-ALD) führt. Diese Erkrankung ist meist durch eine Nebennierenrindeninsuffizienz und eine hohe VLCFA-Konzentration gekennzeichnet und weist je nach Phänotyp ein unterschiedliches Maß an neurologischer Beteiligung auf. So hat die reine Addison-Form der X-ALD keine neurologischen Auswirkungen, während die zerebrale Form der X-ALD häufig zu schweren sensorischen Ausfällen, motorischen Störungen, kognitivem Verfall und Tod führt. Methoden. Eine neu charakterisierte und vermutete pathogene Variante in ABCD1 wurde mit unserer Proteininformatik-Plattform (PIP) analysiert. Zur Ergänzung der Analyse und der klinischen Studie wurden personalisierte molekulare Studien auf Proteinebene anhand der Gentestdaten durchgeführt. Ergebnisse. Ein Fall von Adrenomyeloneuropathie (AMN) bei Erwachsenen und eine neue ABCD1-Variante werden vorgestellt. Das einzigartige ABCD1-Protein wird erörtert, und der Fall des Probanden wird mit bestehenden Berichten über AMN verglichen. Schlussfolgerungen. Die Fusion von Daten aus verschiedenen Quellen wurde in einem umfassenden Ansatz kombiniert, der eine verbesserte Bewertung der Krankheit und der Prognose des Patienten ermöglichte. Für die Variante wurde eine molekulare Modellierung durchgeführt, um ihre klinische Bedeutung besser zu charakterisieren und die Pathogenität zu bestätigen.

1. Einleitung

Das ATP-bindende Kassette, Unterfamilie D, Mitglied 1 (ABCD1) Protein ist Teil der ATP-bindenden Kassetten-Transporter-Superfamilie, die aus Transmembranproteinen besteht, die für den Transport von Lipiden, Metaboliten und anderen Molekülen zwischen Zellen oder intrazellulären Strukturen verantwortlich sind. Es wird von ABCD1 kodiert, einem Gen, das sich auf Xq28 befindet. ABCD1 ist ein peroxisomaler Halbtransporter, der sehr langkettige Fettsäuren (VLCFA) durch Bindung von ATP in das Peroxisom importiert. Dysfunktionales ABCD1 ist nicht in der Lage, VLCFAs zum Abbau in das Peroxisom zu transportieren, was zu einer Anhäufung von VLCFAs in Körperflüssigkeiten und Geweben führt. Diese abnorme Konzentration von VLCFAs dient als charakteristischer Biomarker für die X-chromosomale Adrenoleukodystrophie (X-ALD), die häufigste peroxisomale Störung. X-ALD ist eine genetische Erkrankung, die in erster Linie mit Demyelinisierung, Neurodegeneration und Nebennierenrindeninsuffizienz einhergeht. Innerhalb des ABCD1-Gens wurden über 800 Varianten gemeldet. Trotzdem wurden keine eindeutigen Genotyp-Phänotyp-Korrelationen beobachtet.

Hemizygote Männer zeigen typischerweise die ausgeprägtesten Symptome, während heterozygote Frauen später im Leben oft einen geringeren Grad an Behinderung entwickeln. Die drei klassischen Phänotypen sind die reine Addison-Krankheit, die Adrenomyeloneuropathie (AMN) und die zerebrale ALD. Bei Personen mit der reinen Addison-Krankheit tritt die Nebennierenrindeninsuffizienz in der Regel zwischen 2 und 7 Jahren auf. Die neurologische Degeneration ist anfangs nicht vorhanden, entwickelt sich aber häufig mit zunehmendem Alter. Die AMN tritt typischerweise im dritten bis vierten Lebensjahrzehnt auf und betrifft in erster Linie das Rückenmark. Das erste klinische Merkmal ist häufig eine zunehmende Steifheit und Schwäche der Beine. Eine Nebenniereninsuffizienz findet sich bei etwa 2/3 der AMN-Patienten, und zerebrale Veränderungen betreffen etwa die Hälfte von ihnen. Die zerebrale ALD ist der schwerste Phänotyp, bei dem die zerebrale Demyelinisierung zu einer raschen Verschlechterung des Hör- und Sehvermögens, der Motorik und der kognitiven Fähigkeiten führt. Diese Variante der X-ALD tritt am häufigsten bei Kindern und Jugendlichen auf und führt oft innerhalb von 2 bis 4 Jahren nach Auftreten der Symptome zum Tod.

Dieser Bericht beschreibt die Geschichte eines Probanden, bei dem in seinen Dreißigern AMN diagnostiziert wurde. Bei der molekularen Analyse des ABCD1-Gens wurde bei dieser Person eine Variante von unklarer Bedeutung festgestellt. Interessanterweise wurde diese Variante in der ALD-Mutationsdatenbank als pathogen beschrieben, aber Informationen über den klinischen Fall wurden nicht veröffentlicht. Der klinische Fall unseres Probanden wurde aufgenommen, um die Pathogenität dieser ABCD1-Variante besser belegen zu können. Die Proteininformatik-Plattform (PIP) wurde für eine umfassende molekulare Modellierung verwendet, um die Bedeutung dieser Variante weiter zu charakterisieren und die Diagnose des Probanden zu klären.

2. Fallstudie (klinische Beschreibung)

Der Proband war ein 31-jähriger Mann, der sich zur Untersuchung eines progressiven neurologischen Zustands vorstellte. Die Symptome dieser Erkrankung traten erstmals vor 2 Jahren auf, als der Proband begann, immer häufiger zu stolpern. Später kam es zu einer allgemeinen Muskelschwäche und -steifheit sowie zu weiteren Gangstörungen. Um dem entgegenzuwirken, benutzte der Proband in den letzten 7 Monaten eine Gehhilfe auf Rollen, um das Gehen zu erleichtern. Er hatte auch eine Harninkontinenz entwickelt. Außerdem berichtete er über Hirnnebel, Gedächtnisverlust, Aufmerksamkeitsdefizite, Angstzustände und Müdigkeit. Die Erledigung grundlegender geistiger Aufgaben dauerte infolgedessen länger. Der Alkoholkonsum des Probanden verschlimmerte diese Defizite noch. Schließlich hatte der Proband seit Beginn seiner Erkrankung 20 Pfund abgenommen und war trotz intensiver Bemühungen nicht in der Lage, sein Gewicht wieder zu erhöhen. Dieser Gewichtsverlust war zum Teil auf Symptome von Übelkeit und Erbrechen zurückzuführen, die vor allem morgens auftraten.

Bei der körperlichen Untersuchung war der Proband nicht in der Lage, aus einer sitzenden Position aufzustehen, ohne seine Hände zu benutzen. Es wurde eine leichte ataktische Dysarthrie festgestellt. Visuelle Fixationstests ergaben seltene quadratische Zuckungen. Glatte Verfolgungen waren sakkadisch, und er zeigte langsame, vollständige Sakkaden sowohl in vertikaler als auch in horizontaler Richtung. Die Dehnungsreflexe waren in den oberen Extremitäten pathologisch lebhaft. Der Proband hatte auch pathologisch lebhafte mitotische Dehnungsreflexe in den unteren Extremitäten, einschließlich anhaltendem Klonus an den Knöcheln. Die Propriozeption an den großen Zehen war mäßig beeinträchtigt. In den unteren Extremitäten zeigte sich eine leichte Schwäche der oberen motorischen Neuronenverteilung, wobei der Iliopsoas verschont blieb. Der Fersen-zu-Schienbein-Test ergab eine Dyssynergie. Beim Gehen schaute der Proband auf seine Füße und bewegte sich mit verminderter Schrittlänge. Seine Knie waren überstreckt, er neigte zum Zehengang und rutschte gelegentlich mit den Füßen ab. Das Romberg-Zeichen war vorhanden. Im Stehen traten zittrige Bewegungen in den Beinen auf, vor allem im Quadrizeps. Der Proband drehte sich bei 3 Versuchen um 360 Grad, was 9 bis 15 Schritte pro Drehung erforderte. Seine Haltungsreflexe waren abnormal, und der „Pull“-Test betrug -3.

Die MRT des Gehirns war normal, und die MRT der Halswirbelsäule ergab Befunde, die auf eine leichte, diffuse Rückenmarksatrophie hinwiesen. Es gab keine Hinweise auf eine subakute kombinierte Degeneration oder eine andere erworbene Rückenmarkserkrankung (Abbildung 1). Er war wegen Borreliose behandelt worden, da seine Lyme-IgM-Titer positiv waren, aber es war keine wesentliche Besserung eingetreten. Seine Zerebrospinalflüssigkeit wurde als azellulär beschrieben. Die Untersuchung auf HIV, HTLV1, Hepatitis C, Hepatitis B und Cytomegalovirus verlief negativ. Eine familiäre Vorgeschichte mit ähnlichen Symptomen konnte nicht festgestellt werden, da die Kenntnisse des Probanden über ihre Krankengeschichte begrenzt waren (Abbildung 2).

Abbildung 1

MRT der Halswirbelsäule. Die MRT der Halswirbelsäule ergab Befunde, die auf eine leichte diffuse Rückenmarksatrophie hindeuten.

Abbildung 2

Stammbaum der Familie. Bei den schattierten Personen wurde eine Gangstörung in der Anamnese angegeben. Zeigt an, dass nur eine begrenzte medizinische Vorgeschichte bekannt ist. Der Proband ist mit einem Pfeil markiert.

Das peroxisomale Fettsäureprofil des Probanden wurde nach den vorangegangenen Tests und der Bildgebung erstellt. Es lagen abnorme Konzentrationen von C26 : 0, C24/C22 und C26/C22 vor, was auf eine Hemizygotie für die X-chromosomale Adrenomyeloneuropathie hindeutet. Der Wert des adrenokortikotropen Hormons betrug 528 pg/ml (RR: 7,2-63). Daraufhin wurde eine Sequenzierung und Deletions-/Duplikationsanalyse des ABCD1-Gens durchgeführt. Der Proband war hemizygot für eine Variante von unklarer Bedeutung in ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Diese Variante war in der ExAC-Online-Datenbank nicht vorhanden, obwohl sie in der ALD-Mutationsdatenbank als pathogen aufgeführt war. Zwei ähnliche Varianten, c.1596A>G (p.Lys533Glu) und c.1598A>G (p.Lys533Arg), wurden ebenfalls bereits als klinisch bedeutsam gemeldet.

3. Methoden

3.1. Strukturmodellierung

Die Sequenz von humanem ATP-binding cassette subfamily D member 1 (bekannt als ABCD1) ist wahrscheinlich ein Transporterprotein, das eine nukleotidbindende Region mit einer Faltung besitzt, die als ATP-bindende Untereinheit mit ATPase-Aktivität wirken kann. Es ist bekannt, dass eine korrekte Dimerisierung erforderlich ist, um einen aktiven Transporter zu bilden. ABCD1 ist ein Mitglied der ALD-Unterfamilie, die am peroxisomalen Fettsäureimport in Organellen beteiligt ist. Diese peroxisomalen ABC-Transporter sind „Halbtransporter“, was bedeutet, dass sie ein halbes Transportermolekül als Partner benötigen – die funktionelle Form ist immer homodimer oder heterodimer. Es wird angenommen, dass ABCD1 der Schlüssel für den peroxisomalen Transport oder den Abbau sehr langkettiger Fettsäuren ist. ABCD1 interagiert bekanntermaßen mit PEX19 und wird durch das ABCD1-Gen kodiert, das der NCBI Reference Accession Sequence entnommen wurde: NP_000024: Version NP_000024.2, das für die Aminosäuresequenz kodiert ist, entnommen und für die computergestützte Modellierung verwendet wurde. Monte-Carlo-Simulationen wurden an der Mutante durchgeführt, um lokale regionale Veränderungen für 745 Aminosäuren in voller Länge zu ermöglichen.

Die Röntgenverfeinerung für Monte Carlo wurde mit der YASARA SSP/PSSM-Methode erstellt. Die Struktur wurde mit Hilfe von wissensbasierten Potentialen innerhalb von YASARA auf das YASARA/Amber-Kraftfeld entspannt. Die Seitenketten und Rotamere wurden mit wissensbasierten Potenzialen, simuliertem Annealing mit explizitem Lösungsmittel und kleinen Äquilibrationssimulationen unter Verwendung des YASARA-Verfeinerungsprotokolls angepasst. Die gesamte Struktur wurde in voller Länge modelliert, wobei alle Lücken oder ungelösten Teile aus dem Röntgenbild aufgefüllt wurden.

Die Verfeinerung der fertigen Modelle wurde entweder mit dem LC-MOD-Modul auf Monte-Carlo-Basis von Schrödinger oder mit den NAMD2-Protokollen durchgeführt. Diese Verfeinerungen begannen mit der von YASARA generierten ersten Verfeinerung und Variante. Die Überlagerung und anschließende Verfeinerung der sich überschneidenden Regionen ergibt ein vollständiges Modell für ABCD1. Die endgültigen Strukturen wurden einer Energieoptimierung mit dem konjugierten PR-Gradienten mit einem R-abhängigen Dielektrikum unterzogen.

Die Konsistenz der Atome wurde für alle 745 Aminosäuren (12.201 Atome) des Wildtyp-Modells in voller Länge (WT) und für 745 Aminosäuren (12.221 Atome) für die Variante überprüft, wobei die Korrektheit der Kettennamen, der Dieder, der Winkel, der Torsionen, der Nichtbindungen, der Elektrostatik, der Atomtypisierung und der Parameter überprüft wurde. Es wird ein Dimermodell vorhergesagt, das aus 24 402 Atomen einschließlich Kofaktoren und Ionen besteht. Jedes Modell wurde in die folgenden Formate exportiert: Maestro (MAE), und YASARA (PDB). Die Modellmanipulation erfolgte mit Maestro (Macromodel, Version 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010) oder Visual Molecular Dynamics (VMD). Die Analysen konzentrierten sich auf die N-Terminus-Region, die die ersten 350 Aminosäuren enthält, angesichts der Länge und des C-Terminus-Abstands von der Mutationsstelle.

Monte-Carlo-Dynamik-Suche (hybride MC oder über erweitertes MDS-Sampling) wurde für jedes Modell für Konformations-Sampling abgeschlossen, unter Verwendung von Methoden, die zuvor in der Literatur beschrieben wurden. Kurz gesagt wurde jedes ABCD1-Variantensystem mit entspannten Beschränkungen minimiert, wobei entweder Steepest Descent oder Conjugate Gradient PR verwendet wurde, und dann den MC-Suchkriterien unterzogen, wie in der Literatur beschrieben. Der Hauptzweck von MC in diesem Szenario ist die Untersuchung jeglicher Konformationsvariabilität, die mit verschiedenen Mutationen in der Region nahe der Mutation auftreten kann, und die mögliche Auswirkung auf die DNA-Bindung oder -Prozessierung mit ABCD1.

4. Ergebnisse

4.1. Struktur-Funktions-Studien

Für WT und die Variante p.K533E fanden wir, dass die Stabilität des Objekts aus energetischen Berechnungen für ΔG pro Aminosäure relativ gleich bleibt, so dass WT eine Objektstabilität von 114,67 kcal/mol∗Å2 hat. Die Variante p.K533E führt zu einem Nettoanstieg der freien Energie um 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, was sich destabilisierend auf die lokale Region auswirken könnte. Diese Objektstabilität war positiv, was darauf hindeutet, dass bei einer Molekularsimulation zur Konformationsabtastung einige dynamische Änderungen wahrscheinlich sind. Daher untersuchten wir die lokalen Reste und stellten fest, dass eine elektrostatische Berechnung nützlich sein könnte, um die Veränderung der Funktion zu erklären. Das molekulare Modell für die vollständige Struktur und ihre abgewandelte Form ist dargestellt (Abbildung 3(a)), wobei wir unsere modernen Methoden verwendet haben. Das dimere Modell ist entscheidend für die Funktion und zeigt wichtige Interaktionen an der Mutationsstelle, die durch die Variantenmutation gestört werden.

Abbildung 3

ABCD1 Molekularmodell für die menschliche Sequenz in voller Länge für die Variante p.K533E. (A) Dimeres Modell in voller Länge für die gesamte ABCD1-Struktur des Wildtyps (WT), dargestellt als Bandstruktur mit VdW-Sticks für Position 533. (B) Vergrößerung des Wildtyps für den Lys533-Rest aus dem Volllängenmodell zur besseren Darstellung der interagierenden Reste und der Dimerschnittstelle. Monomer 1 ist grau und Monomer 2 ist orange. Die Reste innerhalb der Interaktionsdistanz zu K533 sind dargestellt, und die gelb gestrichelte Linie steht für H-Bindungen und die rosa gestrichelte Linie für Salzbrücken. (C) Vergrößerung der Region um die Glu533-Variante, die nahe gelegene Reste und die daraus resultierende Verzerrung der „Tasche“ um E533 aufgrund der Ladungsumkehr (+ zu -) zeigt.

Lokale Reste innerhalb des 12 Å-Cutoffs in der Nähe der Variantenstelle (p.K533E) umfassen Reste aus beiden Monomeren. Das Monomer, das die Variante enthält (Monomer 1, graue Kohlenstoffe), hat die folgenden nahe gelegenen Reste mit Wechselwirkungen an Position 533: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535, und K624 (Abbildung 3(b)). Diese Strukturvariante (p.Lys533Glu) wurde analysiert, und es zeigte sich eine deutlichere Störung der lokalen Umgebung, da die positive Ladung des Lysins (+) in eine negative Glutaminsäure (-) umschlägt, was für die benachbarten geladenen Reste (siehe oben) ziemlich störend ist. Insbesondere die Reste K624, E499 und Y532 sind in unterschiedliche Wechselwirkungen eingebunden (Abbildung 3(b)). Lokales ΔG pro Aminosäure erhöht einen positiven Nettowert, der einer ungünstigen Stabilität in der Tasche entspricht, und es wäre eine längere Dynamik erforderlich, um den Gesamteffekt zu bestimmen, aber es ist zu erwarten, dass er destabilisierend ist. Der K533E-Rest hat interessante Wechselwirkungen mit Q472, I474, I475 und E499. K533E befindet sich in einer Helix-Helix-Region, in der seine geladene Seitenkette nach außen zu entgegengesetzt geladenen Spezies positioniert ist; es gibt auch einige Helix-Helix-Wechselwirkungen mit den benachbarten Helices (Abbildungen 3(b) und 3(c)). An der Variante sind dieselben Reste beteiligt, aber die Position mehrerer dieser Reste, einschließlich P534, P535 und K624, ist verändert (Abbildung 3(c)). Diese Wechselwirkung könnte für die veränderte Funktion aufgrund des veränderten dynamischen Verhaltens für die lokale strukturelle Stabilität verantwortlich sein (Abbildung 3(c)). Für die weitere Analyse wurden elektrostatische Berechnungen durchgeführt (Abbildung 4). Insbesondere werden die Reste K624, E499 und Y532 in unterschiedliche Wechselwirkungen gebracht (Abbildung 3(b)). Lokales ΔG pro Aminosäure erhöht einen positiven Nettowert, der einer ungünstigen Stabilität in der Tasche entspricht, und es wäre eine längere Dynamik erforderlich, um die Gesamtwirkung zu bestimmen, aber es kann erwartet werden, dass sie destabilisierend ist.

Abbildung 4

ABCD1 elektrostatische Kartierung des Interaktionspotentials für das Modell in voller Länge für die gesamte ABCD1-Struktur mit der Elektrostatik, die mit Hilfe der Poisson-Boltzman (PB)-Berechnung berechnet wurde, überlagert die Struktur. Der relevante Bereich ist vergrößert dargestellt und zeigt alle Reste innerhalb von 12 Å von der Position des Restes. (A) Die interagierenden Reste, die die Reste umgeben, sind mit der PB-Elektrostatik dargestellt, die ihnen zugeordnet wurde. Die schwarzen Markierungen stehen für Monomer 1-Positionen von Aminosäuren in der Nähe der Reste und die violetten Markierungen für Monomer 2-Positionen von Aminosäuren in der Nähe der zentralen Reste. Die elektrostatische Karte zeigt die Verteilung von negativ zu positiv (rot zu blau) sowie die Konturen und die Form des Proteins in dieser Region. (B) Die Mutantenvariante des ABCD1-Modells ist mit einer elektrostatischen Karte versehen, die die Ladungsveränderungen anzeigt. Die Darstellung ist ähnlich wie bei (A).

4.2. Effekte der Dimerbildung

Die Kartierung der Elektrostatik wurde mit Hilfe der Poisson-Boltzmann-Berechnung für die Solvatation der gesamten 745-Aminosäuren-Struktur durchgeführt. Die Auswirkungen der Änderungen waren bei der elektrostatischen Verteilung mit einem Cutoff von +3 KT/E für beide stark ausgeprägt. Das WT-Partikel (alle 745 aa) zeigt eine ausgeprägte Ladungsverteilung um K533, das aufgrund der reichhaltigen hydrophoben Reste in den oben erwähnten Helices wenige negativ geladene Regionen und große neutrale Taschen aufweist. Die Threonin-Mutation scheint die Verteilung der Ladungen zu verändern und die negativen Ladungen weiter voneinander entfernt zu platzieren, während die Größe der neutral geladenen Regionen zunimmt (Abbildungen 4(a) und 4(b)). Die lokale Region p.K533E ist so geladen, dass der positive Lysinrest mit den benachbarten Glutaminsäureresten übereinstimmt (innerhalb von 6 Å) (Abbildung 4(b)). Umgekehrt hat der Rest K533 positive Ladungen, die von den Resten innerhalb von 6 Å beeinflusst werden, nämlich E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 und K624 (Abbildung 4(a)). Die Variante p.K533E scheint keine Auswirkungen auf das Dimer selbst zu haben (Abbildungen 3 und 4), da die Variante distal zur Schnittstelle zwischen den Monomeren liegt. Es gibt jedoch eine signifikante Störung in der lokalen Umgebung, wo das Lysin von Natur aus in eine Tasche mit seinen benachbarten Resten eingefügt ist, die entgegengesetzt geladen sind und H-Bindungen und Salzbrückenwechselwirkungen eingehen, was mit der negativen Ladung der Glutaminsäure-Substitution verloren geht (Abbildung 3).

5. Diskussion

Für Patienten mit AMN sind die Behandlungsmöglichkeiten derzeit begrenzt. Jüngste Forschungen mit Mausmodellen stellen jedoch eine mögliche Lösung dar. Bei X-ALD-Patienten geht die Anhäufung von VLCFAs mit einem erhöhten Gehalt an radikalen Sauerstoffspezies einher. Diese Radikale treiben das Fortschreiten der Krankheit voran, schädigen das Gewebe und verursachen schließlich das Auftreten neurologischer Symptome. Mäuse mit X-ALD-Analoga wurden erfolgreich mit einer Mischung aus Antioxidantien behandelt, wodurch die Radikalkonzentration unter Kontrolle gebracht und dieser pathogene Prozess aufgehalten werden konnte. Wenn sich spätere Versuche weiterhin als vielversprechend erweisen, ist es möglich, dass unser Proband und andere AMN-Patienten eines Tages auf ähnliche Weise behandelt werden könnten.

Obwohl unser Proband eine schlecht verstandene Variante in ABCD1 aufwies, unterschied sich sein Fall nicht wesentlich vom typischen AMN-Phänotyp. Die Symptome begannen in seinen späten Zwanzigern, was genau in die erwartete Altersspanne von 20 bis 40 Jahren passt. Bei AMN ist typischerweise das Rückenmark betroffen, was durch die MRT-Aufnahmen des Probanden bestätigt wurde. Seine Beinschwäche und seine Gangabweichung sind charakteristisch für die Krankheit, ebenso wie die Harninkontinenz. Erbrechen und Übelkeit werden mit einer Nebenniereninsuffizienz in Verbindung gebracht, während die Sprach- und Denkstörungen des Probanden mit zerebralen Veränderungen in Verbindung gebracht werden könnten. Dennoch muss gesagt werden, dass ein Patient mit der gleichen ABCD1-Variante wie unser Proband unterschiedliche Symptome aufweisen kann. Pathogene ABCD1-Varianten führen selten zu vorhersagbaren Phänotypen, selbst wenn Familienmitglieder eine identische Version besitzen.

Die Proteininformatik, die aus den Berechnungen der statistischen Mechanik abgeleitet wurde, die auf die molekulare Modellierung der Varianten im Vergleich zum Wildtyp angewandt wurde, gibt uns klare Hinweise auf Störungen des normalen Proteinverhaltens auf molekularer Ebene, die sich auf die Funktion auswirken würden. So haben wir beispielsweise herausgefunden, dass die Variante p.K533E einen Nettoanstieg der freien Energie von 2,321 kcal/aamolÅ2 verursacht, wodurch die lokale Region innerhalb von 12 Å des Restes K533 destabilisiert wird. Aufgrund der lokalen Strukturveränderung, die durch Rückgratreste und Sekundärstruktur-Interaktionsänderungen (H-Bindungsnetzwerk nicht gezeigt) abgeschwächt wird, kann sich die korrelierte Bewegung in der gesamten Struktur ausbreiten und die ordnungsgemäße Bildung des Dimers weiter behindern.

Aufgrund der Seltenheit der ABCD1-Variante unseres Probanden war das kommerzielle Labor nicht in der Lage, die Variante mit Sicherheit als pathogen zu bezeichnen. Außerdem machten logistische Herausforderungen und die geringe Familiengröße des Probanden eine Familiensegregationsanalyse unpraktisch. Infolgedessen konnte dieser Prozess nicht abgeschlossen werden, um die Bedeutung seiner Variante besser verstehen zu können. Glücklicherweise bot uns die molekulare Modellierung eine weitere Möglichkeit. Die molekulare Modellierung von Proteinen bestätigte den Verdacht, dass diese Variante die Proteinfunktion in einer klinisch bedeutsamen Weise beeinflussen würde. Es bestand kein Verdacht, dass diese Variante angesichts der groben Strukturveränderung, die durch die PIP-Analyse stark unterstützt wurde, nicht als pathogen eingestuft worden wäre.

6. Schlussfolgerung

Zusammenfassend berichten wir über einen Probanden mit einer seltenen Variante in ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Der Mangel an Informationen über diese Variante hinderte das Gentestunternehmen daran, seine Variante als pathogen einzustufen, aber die molekularen Ladungen scheinen darauf hinzuweisen, dass diese Region des Proteins erheblich aus dem Gleichgewicht gebracht ist (Abbildung 3(b)). Die Verwendung der Proteinmodellierung lieferte auch Informationen, die in das größere Krankheitsbild des Probanden einfließen konnten. Darüber hinaus ist ein Beispiel für die Pathogenität dieser Variante in der ALD-Mutationsdatenbank aufgeführt. Zusammengenommen ermöglichten diese Hinweise eine sichere Diagnose von AMN. Unser Proband hatte typische AMN-Symptome, aber die phänotypische Variabilität, die ABCD1 innewohnt, könnte bei anderen Personen, die diese Variante besitzen, zu einer anderen X-ALD-Präsentation führen.

Abkürzungen

Datenverfügbarkeit

Datensätze und Materialien sind im Manuskript detailliert aufgeführt.

Einverständniserklärung

Alle angewandten Verfahren entsprachen den ethischen Standards des zuständigen Komitees für Experimente am Menschen (institutionell und national) und der Deklaration von Helsinki von 1975 in der im Jahr 2000 überarbeiteten Fassung (5). Von allen Patienten wurde eine informierte Zustimmung zur Teilnahme an der Studie eingeholt.

Interessenkonflikte

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Beiträge der Autoren

Alle oben genannten Autoren leisteten wesentliche Beiträge zur Konzeption oder zum Design der Arbeit; oder zum Erwerb, zur Analyse oder zur Interpretation der Daten für die Arbeit UND zum Entwurf der Arbeit oder zur kritischen Überarbeitung der Arbeit im Hinblick auf wichtige intellektuelle Zustimmung UND gaben die endgültige Genehmigung für die zu veröffentlichende Version UND erklärten sich bereit, für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich zu sein und sicherzustellen, dass Fragen im Zusammenhang mit der Genauigkeit oder Integrität eines Teils der Arbeit angemessen untersucht und gelöst werden.

Finanzierung

Die Finanzierung wurde vom Center for Individualized Medicine der Mayo Clinic zur Verfügung gestellt, das die Mittel für die Durchführung dieser Studie bereitstellte.

Anerkennung

TC dankt dem Center for Individualized Medicine der Mayo Clinic Jacksonville für die Forschungsunterstützung.