Cholesterintransporter ABCA1 und ABCG1 Genexpression in mononukleären Zellen des peripheren Blutes bei Patienten mit metabolischem Syndrom

Abstract

ABCA1 und ABCG1 Gene kodieren die Cholesterintransporterproteine, die eine Schlüsselrolle in der Cholesterin- und Phospholipidhomöostase spielen. Ziel dieser Studie war es, die Expression der ABCA1- und ABCG1-Gene bei Patienten mit metabolischem Syndrom und gesunden Personen zu untersuchen und zu vergleichen. Diese Fall-Kontroll-Studie wurde 2013-2014 an 36 Patienten mit metabolischem Syndrom und der gleichen Anzahl gesunder Personen in Hamadan (Westiran) durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde aus mononukleären Zellen extrahiert und mit einer RNeasy Mini Kit-Säule gereinigt. Die Expression der ABCA1- und ABCG1-Gene wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Das Lipidprofil und der Nüchternblutzucker wurden mit kolorimetrischen Verfahren gemessen. Die ABCG1-Expression war bei Patienten mit metabolischem Syndrom im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant niedriger (etwa 75 %), während bei der ABCA1-Expression kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden untersuchten Gruppen bestand. Der Vergleich anderer Parameter wie HDL-C, FBS, BMI, Taillenumfang sowie systolischer und diastolischer Blutdruck zwischen Patienten mit metabolischem Syndrom und gesunden Personen ergab signifikante Unterschiede (). Die Abnahme der ABCG1-Expression bei Patienten mit metabolischem Syndrom im Vergleich zu gesunden Personen deutet darauf hin, dass Hyperglykämie, verwandte Metaboliten und Hyperlipidämie die Transporterkapazität übersteigen und zu einer verminderten Expression von ABCG1 führen. Das Fehlen einer signifikanten Veränderung der ABCA1-Genexpression zwischen den beiden Gruppen kann auf einen unterschiedlichen Regulationsmechanismus für die ABCA1-Expression hinweisen.

1. Einleitung

Das Metabolische Syndrom (MetS) ist definiert als eine Reihe von miteinander verbundenen Risikofaktoren für Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Es gibt einige Kriterien für die klinische Diagnose des metabolischen Syndroms, zu denen ein erhöhter Taillenumfang (≥102 cm bei Männern und ≥88 cm bei Frauen), erhöhte Triglyceride (≥150 mg/dL oder 1.7 mmol/L), vermindertes High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C <40 mg/dL oder 1,03 mmol/L bei Männern und <50 mg/dL oder 1,3 mmol/L bei Frauen) und erhöhten Blutdruck (≥130 mmHg systolischer Blutdruck oder ≥85 mmHg diastolischer Blutdruck) . Das MetS kann durch die Beobachtung von drei dieser Kriterien diagnostiziert werden. In den letzten Jahren ist die Prävalenz des MetS weltweit gestiegen; in den Vereinigten Staaten von Amerika ist sie jedoch von 25,5 % im Jahr 1999/2000 auf 22,9 % im Jahr 2009/2010 zurückgegangen. Weiss und Kollegen berichteten, dass Fettleibigkeit direkt mit einer erhöhten Prävalenz von MetS verbunden ist. Es besteht ein umgekehrter Zusammenhang zwischen der CVD und dem HDL-C-Plasmaspiegel, einem der Kriterien des Metabolischen Syndroms. High Density Lipoprotein, eine Unterfraktion der zirkulierenden Lipoproteine, spielt eine wichtige Rolle beim Cholesterintransport vom peripheren Gewebe zu den Leberzellen. HDL ist reich an Apo-A-I- und Apo-A-II-Proteinen, und mehr als zwei Drittel seines Inhalts ist Apo A-I.

Die ABC-Transmembrantransporter spielen eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Cholesterin aus Makrophagen in HDL und verringern die Bildung von Schaumzellen. ABCA1 besteht aus 2261 Aminosäuren und kommt in den meisten Geweben vor. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass ABCA1 eine wesentliche Rolle beim Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielt. Die HDL-Synthese hängt direkt von der ABCA1-Aktivität in den Leberzellen ab, d. h. sie hat eine Schlüsselfunktion beim Schutz der Arterienzellen vor Schaumzellen durch die Erhöhung des HDL-Plasmas. Die ABCA1-Aktivität der arteriellen Makrophagen hat eine umgekehrte Assoziation mit der Bildung von Schaumzellen gezeigt, da mit der Erhöhung ihrer Aktivität die Bildung von Schaumzellen reduziert wird.

Die reduzierte oder beeinträchtigte ABCA1-Aktivität könnte einige Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, Tanger-Krankheit und vorzeitige CVD verursachen.

Das ABCG1-Gen befindet sich auf dem Chromosom 21q22.3. Sowohl ABCA1 als auch ABCG1 führen zu einer Verringerung des Gewebecholesterins durch dessen Efflux zu HDL, aber ABCG1 transportiert Gewebecholesterin zu HDL2 und HDL3 und ABCA1 transportiert es zum lipidfreien Apo A-I . Makrophagen sind das wichtigste Gewebe für die Wirkung von ABCA1 und ABCG1. In vielen Studien wurden die Auswirkungen der Hoch- und Herunterregulierung dieser Gene untersucht.

Ein verminderter Cholesterin-Efflux ist die Folge einer fehlenden ABCA1-Expression in vitro; er kann zu einer Zunahme der Atherosklerose führen, aber eine Hochregulierung von ABCA1 führt zu einer Verringerung der Atherosklerose. Eine Herabregulierung von ABCG1 hat ebenfalls dieselben Auswirkungen auf den Cholesterin-Efflux, aber es gibt kontroverse Ergebnisse über die Auswirkungen der Herabregulierung von ABCG1 auf die Atherosklerose.

Bei MetS verändern sich die Expressionsmuster einiger Gene und können zu Fettleibigkeit, Diabetes und Bluthochdruck führen. In der vorliegenden Studie sollte die Expression der Gene ABCA1 und ABCG1 bei Patienten mit MetS untersucht werden, da diese Gene an der Synthese von Transportern beteiligt sind, die eine entscheidende Rolle beim Cholesterintransport spielen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Probanden

Diese Fall-Kontroll-Studie wurde an Patienten durchgeführt, die in den Jahren 2013-2014 in eine endokrinologische Abteilung eines Krankenhauses in Hamadan (im Westen des Iran) überwiesen wurden. Sechsunddreißig Patienten mit metabolischem Syndrom wurden ausgewählt. Außerdem wurden 36 alters- und geschlechtsgleiche gesunde Personen als Kontrollgruppe ausgewählt. Keiner der Gesunden erfüllte die Kriterien des metabolischen Syndroms.

Das Einschlusskriterium für die Gruppe der Patienten mit metabolischem Syndrom war das Vorhandensein von drei der fünf oben genannten Merkmale. Patienten, die in der Vergangenheit Antifett-, Verhütungs- und harntreibende Medikamente eingenommen hatten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Schwangere Patienten und Patienten mit Diabetes, Entzündungen und Infektionen wurden ebenfalls ausgeschlossen.

2.2. Blutentnahme

Eine 2,5 ml große Blutprobe jedes Probanden wurde in ein EDTA-haltiges Röhrchen gegeben und für die RNA-Extraktion bei 4°C aufbewahrt (nicht mehr als zwei Stunden später).

2.3. Extraktion von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)

Für die Isolierung der PBMCs wurden Lösungen von Lymphodex (Deutschland) und Henx (Iran) verwendet. Etwa 2 mL Henx-Lösung wurden dem gleichen Volumen Blut zugefügt und vollständig vermischt; dann wurde es vorsichtig und langsam auf 3 mL Lymphodex-Lösung gegossen. Anschließend wurde die Mischung auf den Lymphodex gegeben und 20 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert. Die weiße Zwischenschicht zwischen Plasma und Lymphodex wurde als mononukleäre Zellen (MCs) isoliert; dann wurde der Henx-Puffer auf die MC gegeben, vollständig gemischt und zentrifugiert. Schließlich wurde der Überstand verworfen und der Vorgang wurde noch einmal wiederholt.

2.4. RNA-Extraktion und cDNA-Synthese

Die Nettoextraktion der RNA wurde mit dem Gene JET RNA Purification Kit gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Qualität und Quantität der gereinigten RNA wurde mit dem NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA) analysiert; anschließend wurde die Integrität jeder RNA-Probe mit Hilfe eines 1%igen Agarosegels und 1x TBE untersucht.

Die RNA wurde mit dem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) nach folgendem Protokoll in cDNA umgewandelt: Schritt 1: Primer-Annealing bei 25°C für 5 min; Schritt 2: cDNA-Synthese bei 42°C für 60 min; Schritt 3: Hitze-Inaktivierung bei 70°C für 5 min. Die Produkte wurden bei -80°C für die nächsten Schritte gelagert.

2.5. Primer Design

Die spezifischen Primer für jedes Gen wurden mit der Allele ID Software (Version 7.6) entworfen. Um die Spezifität der Echtzeit-PCR-Reaktion zu erhöhen und die falsch-positiven Ergebnisse zu reduzieren, wurde einer der Primer jedes Paares so entworfen, dass er an den Exon-Exon-Verbindungsbereich gebunden ist. Die gründlichen Kriterien der verwendeten Primer für jedes Gen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Das 18S rRNA-Haushaltsgen wurde als interne Kontrolle verwendet.

Die relative Expression der Gene wurde durch Messung des Schwellenwert-Zyklus (CT) für jede Probe unter Verwendung des C1000 Thermocyclers und des CFX96 Echtzeitsystems (Bio-Rad, USA) und des SYBR Premix Ex Taq 2 Kits (TakaRa No. RR820L) berechnet. Als CT-Wert wurde der Durchschnitt der CT-Werte in dreifacher Ausführung für jede Probe ermittelt. Die Bestandteile der qRT-PCR-Reaktion umfassten 10 μL SYBR-Grün, 7 μL entionisiertes Wasser und jeweils 1 μL des Vorwärtsprimers, des Rückwärtsprimers und der Vorlage. Die qRT-PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Aktivierung bei 95°C für 30 Sekunden und dann 40 Zyklen der folgenden Schritte: Denaturierung bei 95°C für 5 Sekunden, Annealing bei optimierter Annealing-Temperatur für die richtige Dauer jedes Gens und Verlängerung bei 72°C für 30 Sekunden, und am Ende wurden die Daten durch Erhöhung der Temperatur von 72°C auf 95°C für 0,5°C/0,05 Sekunden erfasst. Dann wurden die PCR-Produkte elektrophoretisch untersucht (auf 1% Agarosegel, 1x TBE), um die Spezifität der Amplikons zu überprüfen.

2.6. Bewertung der biochemischen Faktoren im Serum

Einem Probanden wurde eine 2-Milliliter-Blutprobe entnommen und zur Serumtrennung 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Gesamtcholesterin (TC), LDL-C, TG, FBS und HDL-C wurden mit dem Pars Azmun (Iran) Kit von Hitachi 911 (Deutschland) untersucht.

2.7. Analyse und Interpretation der Ergebnisse

Die Formel wurde für die Analyse der relativen Genexpression der Gruppen mit metabolischem Syndrom und der Kontrollgruppen verwendet. Die Effizienz der Echtzeit-PCR wurde für jedes Gen durch Verwendung einer 10-2-Verdünnung berechnet; anschließend wurde die erhaltene Zahl in die folgende Berechnungsformel zur Messung der Fold Changes der Genexpression eingesetzt: Für die statistische Analyse mit 95 % Konfidenzintervallen wurde die Software SPSS V.16 verwendet. Die Normalverteilung der Variablen wurde mit der Kolmogorov-Smirnov-Methode überprüft, und dann wurden die Werte zwischen zwei Gruppen mit dem Test unabhängiger Stichproben verglichen.

3. Ergebnis

Demographische Merkmale und biochemische Faktoren der untersuchten Gruppen sind in Tabelle 2 dargestellt. Das Verhältnis Männer/Frauen betrug 1/3 in jeder Gruppe (12 M und 24 F). Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, waren die Unterschiede bei allen untersuchten Parametern zwischen den beiden Gruppen statistisch signifikant (), mit Ausnahme des Alters und des LDL-C. Die Gruppe mit metabolischem Syndrom hatte im Vergleich zu den gesunden Personen einen höheren BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, diastolischen/diastolischen Blutdruck und Taillenumfang, während HDL-C beim metabolischen Syndrom signifikant niedriger war.

3.1. Ergebnisse der qRT-PCR

Nach Abschluss der PCR-Reaktion wurden die Ergebnisse durch Analyse der Reaktionskurve, der Schmelzkurve der Produkte und der Elektrophorese der PCR-Produkte überprüft. Die Elektrophorese wurde auf 1% Agarose unter Verwendung einer 100 bp DNA-Leiter durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1

Agarosegelelektrophorese der RT-PCR-Produkte: Spur 1, ABCG1-Produkte mit 135 bp; Spur 2, 18S-RNA-Produkt mit 151 bp; Spur 3, Molekulargewichtsstandards mit 100-1000 bp; Spur 4, Negativkontrolle mit <100 bp; Spur 5, ABCA1-Produkte mit 180 bp.

3.2. Bewertung der Genexpression in PBMC

Die Expressionsniveaus der Gene wurden in den peripheren mononukleären Blutzellen gemessen und zwischen zwei Gruppen durch Berechnung des ΔCT für jedes Gen verglichen. Bei der Expression von ABCA1 gab es keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen, aber die Expression von ABCG1 war in der MetS-Gruppe signifikant niedriger (). Die detaillierten Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Auch die Berechnung der Fold-Change in der ABCG1-Expression () zeigte eine 3,1-fach niedrigere Expression in der MetS-Gruppe.

4. Diskussion

ABCA1 und ABCG1 spielen eine entscheidende Rolle beim Rücktransport von Cholesterin aus peripheren Geweben wie Makrophagen zur Leber. Die Expression der ABCA1- und ABCG1-Gene wurde jedoch bei einigen Krankheiten untersucht; haben wir keinen Bericht über dieses Thema beim metabolischen Syndrom gefunden. In dieser Studie untersuchten wir die Expression dieser Gene bei Personen mit metabolischem Syndrom und gesunden Personen.

Während es keinen signifikanten Unterschied in der ABCA1-Genexpression zwischen den beiden untersuchten Gruppen gab, fanden wir eine signifikant niedrigere Expression (etwa 75%) von ABCG1 bei Personen mit metabolischem Syndrom im Vergleich zur Kontrollgruppe. Singaraja et al. zeigten, dass die verminderte ABCA1-Expression in Makrophagen und Nieren mit einem erhöhten Cholesteringehalt einhergeht. Sie kamen zu dem Schluss, dass ein beeinträchtigter ABCA1-vermittelter Cholesterinexport zu der mit Diabetes verbundenen erhöhten Atherosklerose und Nephropathie beitragen könnte. Es gibt einige Berichte, die sich mit den möglichen Mechanismen befassen, die die Expression dieser Gene regulieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass Polymorphismen in ABCA1 und ABCC8 mit dem metabolischen Syndrom in Verbindung gebracht werden können. Es gibt Hinweise darauf, dass eine Störung der ABCA1-Funktion, die auf eine Mutation in diesem Gen zurückzuführen ist, zu einer familiären Hypoalphalipoproteinämie führen kann, die durch einen niedrigen HDL-Wert und eine erhöhte Ablagerung von Cholesterinestern in verschiedenen Geweben und Zellen gekennzeichnet ist. Außerdem wurde gezeigt, dass eine Überexpression des ABCA1-Gens einen Schutz vor Atherosklerose bieten kann. Diese Daten stimmen mit unseren Ergebnissen überein und unterstützen die Idee, dass eine geringere Expression des ABCA1-Gens zu den Komplikationen des metabolischen Syndroms beitragen kann.

Haghpassand et al. wiesen nach, dass die Expression des ABCA1-Gens in PBMCs in direktem Zusammenhang mit der Cholesterinbelastung steht und dass eine Überexpression von ABCA1 zur Übertragung des überschüssigen Cholesterins auf die Apoproteine führt. Wang et al. untersuchten den umgekehrten Cholesterintransport in ABCA1- und ABCG1-Knockdown-Mäusen und kamen zu dem Schluss, dass der umgekehrte Cholesterintransport bei ABCA1- und ABCG1-Knockdown-Mäusen größer ist als bei ABCG1-Knockdown-Mäusen.

Da Mauerer et al. darauf hinwiesen, dass ein hoher Glukosespiegel (Hyperglykämie) zu einer verminderten ABCA1- und ABCG1-Expression in vitro führt, scheint es logisch, dass ähnliche Veränderungen bei MetS zu erwarten sind. Die Promotoren von ABCA1 und ABCG1 haben Rezeptorstellen für LXR und RXR; wenn Oxycholesterin und Retinsäure mit diesen Faktoren zusammenkommen, wird die Expression von ABCA1 und ABCG1 erhöht. Auch cAMP und NFκB sind Transkriptionsfaktoren für ABCA1 bzw. ABCG1.

Die erzielten Ergebnisse deuten auf einen signifikanten Rückgang der ABCG1-Expression bei Patienten mit metabolischem Syndrom im Vergleich zu gesunden Personen hin. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hyperglykämie, verwandte Metaboliten und Hyperlipidämie über die Transporterkapazität zu einer verminderten Expression von ABCG1 führen können. Da bei der Genexpression von ABCA1 keine signifikante Veränderung beobachtet wurde, kann dies auf einen anderen Regulationsmechanismus zurückzuführen sein. Da die Strukturen dieser Gene unterschiedlich sind und sie durch verschiedene Transkriptionsfaktoren reguliert werden, können unsere Ergebnisse gerechtfertigt sein. Dennoch ist die begrenzte Anzahl der Proben in dieser Studie ein weiterer Faktor für das Fehlen von Veränderungen in der ABCA1-Expression.

Der andere Punkt ist, dass wir die Expression dieser Gene in den PBMC der untersuchten Probanden untersucht haben; es ist wichtig zu beachten, dass die Veränderungen in der Expression dieser Gene in Monozyten anders sein können als in den anderen Schlüsselgeweben wie Leber und Darm, die die Hauptorte der HDL-Synthese sind. Darüber hinaus bedeuten die Veränderungen in den mRNA-Spiegeln nicht notwendigerweise Veränderungen in den zugehörigen Proteinen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Danksagungen

Dieser Artikel ist ein Auszug aus der Masterarbeit von Zahra Tavoosi. Die Autoren möchten der Hamadan University of Medical Sciences für die finanzielle Unterstützung dieser Studie danken.