Diagnostische Aussagekraft von Labortests bei hereditärer Sphärozytose: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics

Abstract

Hintergrund Die Labordiagnose der hereditären Sphärozytose stützt sich in der Regel auf osmotische Fragilitätstests für Erythrozyten auf NaCl- oder Glycerinbasis; in jüngerer Zeit wurde ein Test vorgeschlagen, der direkt auf den molekularen Defekt der hereditären Sphärozytose abzielt (Eosin-5′-Maleimid-Bindungstest). Keiner der verfügbaren Tests identifiziert alle Fälle von hereditärer Sphärozytose.Design und Methoden Wir verglichen die Leistungen des Eosin-5′-Maleimid-Bindungstests, NaCl-osmotische Fragilitätsstudien an frischem und bebrütetem Blut, des Glycerin-Lyse-Tests, des angesäuerten Glycerin-Lyse-Tests und des Pink-Tests an einer Reihe von 150 Patienten mit hereditärer Sphärozytose, die nach klinischem Phänotyp und defektem Protein gruppiert waren, mit dem Endziel, die Kombination von Tests zu finden, die mit der höchsten diagnostischen Aussagekraft verbunden ist, selbst in den mildesten Fällen von hereditärer Sphärozytose.Ergebnisse Der Eosin-5′-Maleimid-Bindungstest wies eine Sensitivität von 93 % und eine Spezifität von 98 % für den Nachweis der hereditären Sphärozytose auf: Die Sensitivität war unabhängig von der Art und Menge des molekularen Defekts und vom klinischen Phänotyp. Der Test mit angesäuertem Glycerin und der Pink-Test zeigten eine vergleichbare Sensitivität (95% und 91%). Die Sensitivität des osmotischen NaCl-Fragilitätstests, der gemeinhin als Goldstandard für die Diagnose der hereditären Sphärozytose gilt, betrug 68 % bei frischem Blut und 81 % bei bebrütetem Blut, wobei sie bei kompensierten Fällen weiter abnahm (53 % bzw. 64 %). Durch die Kombination des Eosin-5′-Maleimid-Bindungstests mit dem sauren Glycerin-Lysetest konnten alle Patienten mit hereditärer Sphärozytose identifiziert werden. Der Eosin-5′-Maleimid-Bindungstest zeigte die größte Krankheitsspezifität.Schlussfolgerungen Jede Art von Test kann einige Fälle von hereditärer Sphärozytose nicht diagnostizieren. Die Kombination eines Eosin-5′-Maleimid-Bindungstests mit einem Test zur Lyse von saurem Glycerin ermöglichte die Identifizierung aller Patienten mit hereditärer Sphärozytose in dieser Serie und stellt daher eine derzeit wirksame Diagnosestrategie für hereditäre Sphärozytose dar, einschließlich leichter/kompensierter Fälle.

Einführung

Hereditäre Sphärozytose ist die häufigste angeborene hämolytische Anämie bei Kaukasiern und betrifft etwa 1 von 1000-2000 Personen.1,2 Der molekulare Defekt ist sehr heterogen und betrifft die Gene, die für Spectrin, Ankyrin, Band 3 und Protein 4 kodieren.2,3 Der Grad der Hämolyse variiert stark und reicht von einer vollständig kompensierten bis hin zu einer transfusionsabhängigen Anämie.

Das typische Labormerkmal der hereditären Sphärozytose, wenn auch nicht spezifisch, ist das Vorhandensein von Sphärozyten in einem peripheren Blutausstrich, die bei 97 % der Patienten nachweisbar sind.4 Bei einigen Patienten können jedoch nur sehr wenige Sphärozyten vorhanden sein4,5 , so dass zu ihrer Erkennung geschultes Personal erforderlich ist; außerdem wird im Zeitalter der Laborautomatisierung zunehmend auf die mikroskopische Untersuchung der Erythrozyten verzichtet. Die Labordiagnose der hereditären Sphärozytose stützt sich daher in der Regel auf Tests, die das bei kugelförmigen Erythrozyten typischerweise reduzierte Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ausnutzen, insbesondere Tests zur osmotischen Fragilität der Erythrozyten bei verschiedenen Natriumchlorid (NaCl)-Konzentrationen an frischem und bebrütetem Blut6 und Tests, die das Ausmaß oder die Geschwindigkeit der Lyse von in gepufferten Glycerinlösungen suspendierten Erythrozyten messen, d. h. die Glycerinlyse.d. h. der Glycerin-Lyse-Test (GLT),7 der angesäuerte Glycerin-Lyse-Test (AGLT)8 und der Pink-Test.9 Diese Tests erfassen jedoch einen variablen Anteil der Fälle von hereditärer Sphärozytose nicht, insbesondere die mildesten Fälle,6,10-12 und unterscheiden nicht zwischen hereditärer Sphärozytose und sekundärer Sphärozytose, die mit anderen Erkrankungen, hauptsächlich autoimmunen hämolytischen Anämien, einhergeht.13-15

In jüngerer Zeit wurden der Kryohämolysetest16,17 , der auf der Beobachtung beruht, dass Erythrozyten von Patienten mit hereditärer Sphärozytose besonders empfindlich auf die Abkühlung bei 0° C unter hypertonen Bedingungen reagieren, und die durchflusszytometrische Analyse von Eosin-5′-Maleimid-markierten intakten Erythrozyten (EMA-Bindungstest)18 als neue Methoden zur Identifizierung der hereditären Sphärozytose vorgeschlagen.19 Insbesondere der letztgenannte Test hat sich als empfindlicher und spezifischer Diagnosetest für hereditäre Sphärozytose12,18,20-29 erwiesen, der direkt auf die strukturelle Läsion dieser Krankheit abzielt, da die fluoreszierende Sonde, Eosin-5′-Maleimid, mit dem Protein-Band-3-Komplex interagiert.30

Die Leistung der verfügbaren direkten oder indirekten Diagnosetests wurde meist einzeln und an einer begrenzten Anzahl von Fällen bewertet. Die Empfindlichkeit der Tests ist sehr unterschiedlich, und mit jeder Methode werden mehrere Patienten mit hereditärer Sphärozytose nicht erkannt.4,6,12 In dieser Studie haben wir die Leistungen der EMA-Bindung, der NaCl-induzierten osmotischen Fragilität von frischem und inkubiertem Blut, des GLT, des AGLT und des Pink-Tests bei einer Reihe von 150 Patienten mit hereditärer Sphärozytose verglichen, die nach dem klinischen Phänotyp und der molekularen Läsion gruppiert waren, mit dem Endziel, die Kombination von Tests zu finden, die mit der höchsten diagnostischen Kraft für hereditäre Sphärozytose verbunden ist, einschließlich der leichtesten Fälle, die normalerweise schwer zu diagnostizieren sind.

Design und Methoden

Probanden

Einhundertfünfzig konsekutive Patienten mit hereditärer Sphärozytose (79 Männer und 71 Frauen, mittleres Alter 26 Jahre, Spanne 0-79 Jahre) aus 128 nicht verwandten Familien wurden untersucht. Zum Zeitpunkt der Studie waren 22 Patienten splenektomiert und 128 nicht splenektomiert.

Alle Patienten wurden klinisch und körperlich untersucht und folgenden Labortests unterzogen: komplettes Blutbild, Blutausstrich, Retikulozytenzahl, Bestimmung der Bilirubin- und Haptoglobinkonzentration, Beurteilung des Eisenstatus, direkter Antiglobulintest (DAT), Screening auf abnorme oder instabile Hämoglobine, osmotischer NaCl-Fragilitätstest an frischem und inkubiertem Blut, GLT, AGLT, Pink-Test und EMA-Bindungstest. In einigen Fällen wurde die Aktivität der wichtigsten Enzyme des glykolytischen und des Pentosephosphatweges untersucht. Bei einigen wenigen Patienten wurde auch die mitogen-stimulierte DAT31 durchgeführt, um die Diagnose einer DAT-negativen hämolytischen Anämie auszuschließen.

Die Diagnose der hereditären Sphärozytose wurde auf der Grundlage klinischer und labortechnischer Anzeichen einer chronischen Hämolyse, des Vorhandenseins von Sphärozyten bei der Untersuchung des peripheren Blutausstrichs, der Positivität mindestens eines Erythrozyten-Fragilitätstests, einer etwaigen Familienanamnese einer hereditären Sphärozytose und des Ausschlusses anderer Ursachen für eine sekundäre Sphärozytose gestellt.19 Die Anämie wurde als schwer (Hb<8 g/dL), mittelschwer (Hb 8-10 g/dL), leicht (Hb>10 und <11,5 g/dL bei Frauen und Hb>10 und <13,5 g/dL bei Männern) und kompensiert (Hb>11,5 g/dL bei Frauen und >13,5 g/dL bei Männern) definiert.

Proben aller Patienten wurden zur Analyse der Erythrozytenmembranproteine einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen und danach eingeteilt, ob ein Mangel an Bande 3, Spektrin oder Ankyrin, ein kombinierter Spektrin/Ankyrin-Mangel oder kein nachweisbarer Defekt vorlag.4

Fünfhundertfünfundsiebzig gesunde Blutspender und 84 Fälle mit hämolytischer Anämie außer hereditärer Sphärozytose (17 mit autoimmuner hämolytischer Anämie, 10 mit Erythrozytenenzymstörungen, 10 mit hereditärer Elliptozytose, 15 mit kongenitaler dyserythropoetischer Anämie, 9 mit paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie, 3 mit Stomatozytose, 3 mit mechanischer Anämie und 17 mit Anämie unbekannter Ursache) wurden ebenfalls untersucht.

Hämatologische Untersuchungen

Peripheres Blut wurde den Patienten und den Kontrollpersonen während der diagnostischen Verfahren entnommen, nachdem die Einwilligung nach Aufklärung und die Genehmigung des institutionellen Ausschusses für Humanforschung eingeholt worden war. Die angewandten Verfahren standen im Einklang mit den internationalen ethischen Standards von Helsinki für Experimente am Menschen. Die meisten Proben wurden in unserem Institut entnommen; die von anderen Zentren stammenden Proben wurden bei einer Temperatur von 4 °C versandt und stets innerhalb von 24 Stunden verarbeitet. Keiner der Patienten war innerhalb der letzten 3 Monate vor der Studie transfundiert worden. Die hämatologischen Parameter wurden mit einem automatischen Hämatologie-Analysegerät (Automatic Beckman Coulter LH-750, CA, USA) bestimmt. Die hämatologischen Routineuntersuchungen wurden nach Dacie & Lewis durchgeführt.32 Bilirubin-, Haptoglobin- und Ferritinwerte wurden mit dem Integra 800 (Roche, Mannheim, Deutschland) bestimmt. Die Anzahl der Sphärozyten im peripheren Blut wurde von zwei unabhängigen und fachkundigen Personen bestimmt. Die osmotische Fragilität der Erythrozyten wurde durch die Durchführung des osmotischen NaCl-Fragilitätstests an frischem und inkubiertem Blut,6 des Standard-GLT,7 des AGLT8 und des Pink-Tests9 an Proben jedes Patienten bewertet.

Der EMA-Bindungstest wurde wie von King et al.18 beschrieben mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Insbesondere wurde die Fluoreszenzintensität, ausgedrückt als mittlere Kanalfluoreszenz, für 10.000 Ereignisse im FL-1-Kanal mit einem Becton Dickinson FACSCanto II Durchflusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) bestimmt. Die EMA-Farbstoff-Stammlösung wurde in kleinen Aliquoten bei -80° C über einen Zeitraum von 6 Monaten gelagert. Der Test wurde einmal wöchentlich durchgeführt, wobei alle Fälle am selben Tag gruppiert wurden25 , nachdem die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse an Blutproben, die bis zu sechs Tage bei 4°C gelagert wurden, bestätigt worden war.

Um die Intra-Assay-Varianz zu verringern, wurden die Proben der Patienten mit denen von sechs normalen Kontrollen verglichen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Fluoreszenzverringerung der Patientenprobe im Vergleich zur mittleren Fluoreszenz der sechs normalen Kontrollen ausgedrückt, wie von Girodon et al. vorgeschlagen.25 Eine auf einer logistischen Regressionsanalyse basierende Receiver-Operating-Characteristic-Kurve (ROC-Kurve) wurde verwendet, um den optimalen Cut-off-Wert zwischen den Werten von Patienten mit hereditärer Sphärozytose und denen von normalen Personen zu bestimmen. Nach der Analyse der ROC-Kurve lag die optimale Abnahme der Fluoreszenz zur Unterscheidung zwischen normalen Personen und Patienten mit hereditärer Sphärozytose bei 11 %. Unter diesen Bedingungen lag die an 575 gesunden Probanden berechnete Testspezifität bei 98 %.

Erythrozyten-Ghosts wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Blutentnahme nach der von Dodge et al.33 beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen präpariert.4 Erythrozyten-Membranproteine wurden innerhalb von 15 Tagen nach der Ghost-Präparation mittels SDS-PAGE unter Verwendung eines Acrylamid-Gradienten von 4 % bis 12 % nach Fairbanks et al.34 und dem diskontinuierlichen Puffersystem von Laemmli35 mit einem linearen Acrylamid-Gradienten von 6 % bis 14 % analysiert, wie zuvor beschrieben.4 Die Aktivitäten der Enzyme des glykolytischen und des Pentosephosphatwegs wurden nach den von Beutler beschriebenen Methoden bestimmt.36

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt die hämatologischen und biochemischen Daten der Patienten mit hereditärer Sphärozytose, gruppiert danach, ob sie vor dem Zeitpunkt der Studie nicht splenektomiert oder splenektomiert worden waren, und nach dem klinischen Phänotyp (nur bei nicht splenektomierten Patienten). Die Mehrheit der nicht splenektomierten Patienten hatte eine leichte bis kompensierte Hämolyse; 18 % hatten nur sehr wenige Sphärozyten (≤3 %). Die häufigsten Proteinanomalien waren Spektrin- und Band 3-Mängel sowohl bei nicht splenektomierten als auch bei splenektomierten Patienten. Der Membranproteindefekt war bei neun (7 %) nicht-splenektomierten Patienten nicht nachweisbar, von denen sieben eine positive Familienanamnese für hereditäre Sphärozytose aufwiesen; die übrigen zwei wiesen eine leichte Anämie, Retikulozytose und 5 % Sphärozyten auf, ohne dass andere Ursachen für eine chronische hämolytische Anämie vorlagen.

Tabelle 2 vergleicht die Sensitivität der diagnostischen Labortests für hereditäre Sphärozytose. Mit der EMA-Bindung konnten 10/150 (7 %) Fälle nicht identifiziert werden (4 mit Banden-3-Mangel, 5 mit Spektrin-Mangel und 1 mit einem nicht erkannten Defekt). Die mittlere Abnahme der Fluoreszenz betrug 27 % ± 10 % bei Patienten mit hereditärer Sphärozytose gegenüber 0 % ± 8 % bei Referenzpersonen (P<0,001). Die prozentuale Fluoreszenzabnahme stand in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der Sphärozyten und indirekt mit dem mittleren korpuskulären Volumen; es wurde keine Korrelation mit der Hämoglobinkonzentration, der absoluten Anzahl der Retikulozyten oder der Breite der Erythrozytenverteilung festgestellt. Die Sensitivität des Tests war unabhängig von der Art und dem Ausmaß des molekularen Defekts, wenngleich sie bei Patienten mit nicht erkannten Defekten, die im Median die geringste Abnahme der Fluoreszenz aufwiesen, etwas geringer war (15 % gegenüber 30 % bzw. 28 % bei Band 3 und Spektrinmangel). Es ist erwähnenswert, dass die Sensitivität des EMA-Bindungstests bei splenektomierten Patienten etwas höher war als bei nicht-splenektomierten Patienten (Abbildung 1).

Die Sensitivität der verschiedenen untersuchten Erythrozyten-Fragilitätstests war sehr variabel und im Allgemeinen bei splenektomierten Patienten höher als bei nicht-splenektomierten Patienten mit hereditärer Sphärozytose und niedriger (mit Ausnahme von AGLT) bei Patienten mit unentdeckten Defekten als bei Patienten mit nachweisbaren Defekten (Tabelle 2A). Was den osmotischen NaCl-Fragilitätstest betrifft, so war die Sensitivität größer, wenn er mit bebrütetem Blut durchgeführt wurde als mit frischem Blut. Insgesamt hatten die osmotischen NaCl-Fragilitätstests (sowohl mit frischem als auch mit bebrütetem Blut) eine geringere Empfindlichkeit als die üblicherweise verwendeten Tests auf Glycerinbasis. Unter den letztgenannten Tests hatte der AGLT die höchste Sensitivität, auch in den Fällen mit unentdeckten Defekten, vergleichbar mit der des EMA-Bindungstests.

Tabelle 1: Hämatologische und biochemische Daten von Patienten mit hereditärer Sphärozytose, gruppiert danach, ob sie splenektomiert waren oder nicht.

Alle Patienten mit hereditärer Sphärozytose waren in mindestens zwei verschiedenen Tests positiv, mit Ausnahme von zwei Patienten (1 mit Band 3-Mangel und 1 mit Spectrin-Mangel), die nur im EMA-Bindungstest positiv waren. Wir stellten fest, dass die Kombination von EMA und AGLT die Identifizierung aller Patienten mit hereditärer Sphärozytose ermöglichte (Tabelle 2B). Insbesondere waren 133/150 (88 %) der Fälle von hereditärer Sphärozytose EMA-positiv und AGLT-positiv, 7/150 (5 %) waren EMA-positiv und AGLT-negativ und 10/150 (7 %) waren EMA-negativ und AGLT-positiv.

Wenn die Leistung der verschiedenen Tests bei nicht plenektomierten Patienten in Abhängigkeit vom klinischen Phänotyp analysiert wurde, behielten die EMA-Bindung, der AGLT und der Pink-Test ihre hohe Sensitivität in den verschiedenen klinischen Untergruppen bei, während die Sensitivität des osmotischen NaCl-Fragilitätstests bei frischem Blut und nach Inkubation bei kompensierten Fällen deutlich abnahm (Abbildung 1).

Die Ergebnisse verschiedener Tests bei einer Reihe von 84 Patienten mit anderen hämolytischen Erkrankungen als hereditärer Sphärozytose sind in Abbildung 2 dargestellt. Die EMA-Bindung zeigte die größere Krankheitsspezifität, da sie bei allen Patienten mit autoimmuner hämolytischer Anämie negativ war, selbst bei Vorliegen einer ausgeprägten Sphärozytose.

Diskussion

Dies ist die erste umfassende Vergleichsstudie der derzeit am häufigsten verwendeten Labormethoden zur Diagnose der hereditären Sphärozytose, die an einer großen Anzahl von Patienten durchgeführt wurde, die nach dem molekularen Defekt, dem Grad der Hämolyse und dem Vorhandensein oder Fehlen der Milz gruppiert wurden. Die Feststellung, dass die Hälfte der untersuchten Patienten eine leichte/kompensierte Anämie hatte und daher schwieriger zu diagnostizieren war, und dass 18 % nur sehr wenige Sphärozyten im peripheren Blutausstrich aufwiesen, macht die untersuchte Population besonders geeignet für Sensitivitätsstudien. Den Kryohämolysetest17 haben wir nicht in diese Studie einbezogen, da die Grundlage der Empfindlichkeit der Erythrozyten bei hereditärer Sphärozytose gegenüber Kühlung bisher nicht geklärt ist und die Meinungen über seine routinemäßige Anwendung für die Diagnose der hereditären Sphärozytose kontrovers sind.4,5,16,17,19,37,38

Tabelle 2.(A) Empfindlichkeit der Einzeltests bei Patienten mit hereditärer Sphärozytose (HS), gruppiert nach dem biochemischen Defekt. (B) Die Sensitivität kombinierter Tests bei allen HS-Fällen. Die Zahl stellt das Verhältnis der positiven Fälle/Gesamtfälle dar, wobei die Prozentwerte in Klammern angegeben sind.

Abbildung 1: Sensitivität verschiedener diagnostischer Tests bei 22 splenektomierten und 128 nicht splenektomierten Patienten mit hereditärer Sphärozytose (HS). Nicht-splenektomierte Patienten mit HS wurden nach dem klinischen Phänotyp eingeteilt.

Unter den in Betracht gezogenen diagnostischen Methoden ist der kürzlich vorgeschlagene EMA-Bindungstest sicherlich die interessanteste, und er wird wegen seiner hohen Sensitivität und Spezifität zunehmend von spezialisierten Labors eingesetzt.12,18,2329 Diese Methode zielt direkt auf die strukturelle Läsion der Krankheit ab, da die fluoreszierende Sonde Eosin-5′-Maleimid mit den Transmembranproteinen Band 3, Rh-Protein, Rh-Glykoprotein und CD47 interagiert, die in Erythrozyten von Patienten mit hereditärer Sphärozytose reduziert sind;30 Defekte anderer Zytoskelettproteine wie Spectrin und Protein 4.2, führen ebenfalls zu einer Verringerung der Fluoreszenzintensität, wahrscheinlich weil sie einen weitreichenden Modulationseffekt auf die Farbstoffbindungsstelle im Band 3-Protein erzeugen.39 Die Sensitivität des EMA-Bindungstests in dieser Serie ist höher als die kürzlich von Crisp et al.12 gemeldete und ähnlich wie die von anderen gefundene;18,23-29 darüber hinaus scheint die Leistung des Tests unabhängig von der Art des Erythrozytenmembranproteinmangels zu sein und nimmt bei Patienten mit hereditärer Sphärozytose mit einem nicht nachweisbaren Defekt nur geringfügig ab, was mit den Beobachtungen von King et al.18 und Girodon et al.25 übereinstimmt. Die getrennte Analyse von nicht-splenektomierten und splenektomierten Patienten mit hereditärer Sphärozytose zeigte, dass die Sensitivität in der letzteren Gruppe höher war, ein Befund, der generell für alle untersuchten Tests gilt; diese Beobachtung verdeutlicht die Notwendigkeit, die klinischen Merkmale der Patienten genau zu definieren, wenn die Leistungsfähigkeit der diagnostischen Methoden für hereditäre Sphärozytose getestet wird, und möglicherweise die Analyse auf nicht-splenektomierte Patienten zu beschränken. Ein weiterer Vorteil des EMA-Bindungstests besteht darin, dass die Ergebnisse nicht durch den Versand oder eine Lagerung von bis zu 6 Tagen beeinflusst werden, wie in Abbildung 3 dargestellt, so dass der Versand von Proben möglich ist, wie von Girodon et al.25 berichtet. Außerdem werden die Ergebnisse nicht durch kürzlich erfolgte Transfusionen beeinflusst, da die Methode verschiedene Erythrozytenpopulationen unterscheidet.20

Abbildung 2: Ergebnisse einzelner diagnostischer Tests bei Patienten mit hämolytischen Anämien, die keine hereditäre Sphärozytose (HS) sind, im Vergleich zu Patienten mit HS. Der schattierte Bereich stellt normale Referenzintervalle dar. CDA: kongenitale dyserythropoetische Anämie; AIHA: autoimmune hämolytische Anämie; HE: hereditäre Elliptozytose; PNH: Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie

Was die osmotischen NaCl-Fragilitätstests betrifft, so haben wir festgestellt, dass diese fast ein Viertel der Patienten mit hereditärer Sphärozytose nicht identifizieren konnten, was die Ergebnisse anderer Forscher bestätigt,12,13,19,40,41 und dass ihre Sensitivität im Allgemeinen geringer war als die der anderen diagnostischen Labortests, die in dieser Serie ausgewertet wurden. Trotzdem gilt die osmotische Fragilität bei der Inkubation von NaCl immer noch als Goldstandard für die Diagnose der hereditären Sphärozytose bei Patienten mit Coombs-negativen hämolytischen Anämien.5,11,42 In der Tat zeigt die Analyse der Literatur, dass in der Vergangenheit keine systematischen Studien zur Sensitivität dieses Tests durchgeführt wurden und dass die Behauptung, er sei die beste Methode zur Diagnose der hereditären Sphärozytose, auf Studien beruht, die an einer begrenzten Anzahl von Patienten mit nicht klar definierten klinischen Merkmalen durchgeführt wurden; außerdem kann die Interpretation der osmotischen NaCl-Fragilitätskurven in weniger typischen Fällen schwierig sein.8 Die hohe Zahl der in dieser Serie berücksichtigten Patienten ermöglichte es uns, die Leistung des osmotischen NaCl-Fragilitätstests mit der klinischen Ausprägung der Krankheit zu korrelieren: Die Beobachtung, dass bei kompensierter hereditärer Sphärozytose die Sensitivität des osmotischen Fragilitätstests auf fast 60 % abnahm, was weitaus mehr ist, als von Korones & Pearson berichtet wurde,13 schränkt den Nutzen dieser Methode bei den leichtesten und weniger typischen Fällen weiter ein. Dies wird auch durch die Feststellung bestätigt, dass die Sensitivität bei Patienten mit hereditärer Sphärozytose mit einem nicht nachweisbaren biochemischen Defekt auf 30 % sinkt.

Die Erythrozytenfragilitätstests auf Glycerinbasis sind mit Ausnahme der Originalversion des GLT empfindlicher als der osmotische NaCl-Fragilitätstest; insbesondere hatte der AGLT in dieser Serie eine Sensitivität von 95 %, ähnlich wie bei anderen1,15,43,44 und höher als die von Cynober et al.10 und Bucx et al.45 Die Sensitivität des AGLT war auch bei kompensierten Fällen und bei solchen mit einem nicht erkannten biochemischen Defekt hoch. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass der AGLT die zehn EMA-negativen Fälle von hereditärer Sphärozytose identifizierte.

Die Assoziation von EMA-Bindung und AGLT ermöglichte die Identifizierung aller Fälle von hereditärer Sphärozytose in dieser Serie; da Durchflusszytometer nicht in allen Diagnoselabors verfügbar sind, ist es erwähnenswert, dass der AGLT zusammen mit dem osmotischen NaCl-Fragilitätstest an bebrütetem Blut die diagnostische Sensitivität auf 97 % erhöht, was dem zuvor in einer größeren Patientenserie berichteten Wert entspricht4: In jedem Fall ist dieser Wert höher als der, der durch die Kombination von EMA-Bindung und Kryohämolysetest erzielt wird, wie kürzlich von Crisp et al.12

Abbildung 3.(A) Mittlere Kanalfluoreszenzwerte bei normalen Kontrollen und Patienten mit hereditärer Sphärozytose (HS) an verschiedenen Tagen der Lagerung. (B-C) Ergebnisse des EMA-Bindungstests bei Proben von 150 HS-Patienten, gruppiert nach Versand (B) und Tagen der Lagerung vor dem Test (C). ■ Kontrollen, – HS nicht versandt, ○ HS versandt.

Abbildung 4.Flussdiagramm zur Labordiagnose der hereditären Sphärozytose (HS).

Die Krankheitsspezifität der diagnostischen Tests für hereditäre Sphärozytose wurde bewertet, indem eine große Gruppe von Patienten mit verschiedenen Arten von hämolytischer Anämie einbezogen wurde, die morphologische und labortechnische Merkmale aufweisen können, die denen der hereditären Sphärozytose ähneln. Wie erwartet standen die Ergebnisse der EMA-Bindung, ausgedrückt als prozentuale Fluoreszenzverminderung, nur bei Patienten mit hereditärer Sphärozytose in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der Sphärozyten, nicht aber bei Patienten mit autoimmuner hämolytischer Anämie, selbst bei denen mit ausgeprägter Sphärozytose: Diese Beobachtung steht im Einklang mit der von anderen berichteten hohen Krankheitsspezifität dieses Tests.19-21,25 Wir haben festgestellt, dass die anderen Tests, insbesondere die auf Glycerin basierenden, weniger spezifisch sind als die EMA-Bindung, da sie, wie bereits berichtet,8,9,14,15,46 auch bei erworbenen hämolytischen Anämien häufig positiv sind. Es ist erwähnenswert, dass keiner der verfügbaren diagnostischen Tests für hereditäre Sphärozytose, weder direkt noch indirekt, eine Unterscheidung zwischen hereditärer Sphärozytose und kongenitaler dyserythropoetischer Anämie Typ II ermöglicht. Die letztgenannte Erkrankung ist zwar weniger verbreitet als die hereditäre Sphärozytose, kann aber das klinische Erscheinungsbild, die Morphologie der Erythrozyten und die erhöhte osmotische Fragilität der Erythrozyten der hereditären Sphärozytose ähneln und kann durch eine SDS-PAGE-Analyse identifiziert werden: Mariani et al. berichteten, dass sich 13 % der an ein Referenzlabor überwiesenen Fälle mit der vorläufigen Bezeichnung „hereditäre Sphärozytose“ bei einer SDS-PAGE-Untersuchung als kongenitale dyserythropoetische Anämie Typ II herausstellten.47

Die bisher einzigen diagnostischen Leitlinien für hereditäre Sphärozytose des British Committee for Standards in Hematology,19 empfehlen als Screening-Methode entweder die EMA-Bindung oder den Kryohämolysetest,16 wobei die Verfügbarkeit eines Durchflusszytometers ausschlaggebend für die Wahl ist. In den Leitlinien wird nicht angegeben, ob bei mehrdeutigen oder grenzwertigen Ergebnissen beide Tests durchgeführt werden sollten. In jedem Fall ergibt selbst die Kombination dieser beiden Tests eine Sensitivität von 93 %, die ähnlich hoch ist wie die Sensitivität der EMA-Bindung oder des AGLT allein und viel niedriger als die Sensitivität der Kombination von EMA-Bindung und AGLT.

Wie in Abbildung 4 zu sehen ist, kann bei einem Patienten mit DAT-negativer chronischer Hämolyse mit Sphärozyten durch die Negativität sowohl von EMA als auch von AGLT eine hereditäre Sphärozytose ausgeschlossen werden. Eine positive EMA-Bindung (mit einem positiven oder negativen AGLT) führt zur Diagnose einer hereditären Sphärozytose, außer in den nicht dominanten Fällen mit unzureichender Retikulozytose11 , die eine SDS-PAGE-Analyse zum Ausschluss einer kongenitalen dyserythropoetischen Anämie Typ II erfordern. Eine SDS-PAGE-Analyse kann auch in den seltenen EMA-negativen, AGLT-poistiven Fällen mit negativer Familienanamnese erforderlich sein, da AGLT weniger krankheitsspezifisch ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kein einziger Test in der Lage ist, alle Fälle von hereditärer Sphärozytose zu identifizieren. Die Kombination von EMA-Bindung, die direkt auf den strukturellen Defekt der hereditären Sphärozytose abzielt, und AGLT, der das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen der Erythrozyten ausnutzt, ermöglichte es uns, alle Patienten mit hereditärer Sphärozytose in dieser Serie zu identifizieren, und stellt daher eine sehr wirksame Diagnosestrategie für die hereditäre Sphärozytose auch in leichten/kompensierten Fällen dar. Es muss jedoch betont werden, dass die Diagnose der hereditären Sphärozytose der letzte Schritt einer diagnostischen Abklärung ist, die nicht nur auf Labortests, sondern auch auf der klinischen Untersuchung, der persönlichen Familienanamnese und dem Ausschluss möglicher Ursachen einer sekundären Sphärozytose beruht.

Fußnoten

• Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Stiftung IRCCS Ca‘ Granda Ospedale Maggiore Policlinico von Mailand, RC2009 160/01 und ENERCA III Projekt, EC 2008, convention n. 210.
• Autorenschaft und OffenlegungDie Informationen der Autoren über Beiträge von Personen, die als Autoren und in Danksagungen aufgeführt sind, sind mit dem vollständigen Text dieser Arbeit unter www.haematologica.org.
• Finanzielle und andere Angaben, die von den Autoren unter Verwendung des ICMJE (www.icmje.org) Uniform Format for Disclosure of Competing Interests gemacht wurden, sind auch unter www.haematologica.org verfügbar.

• Received August 4, 2011.
• Revision received October 11, 2011.
• Accepted October 26, 2011.

1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalence of increased osmotic fragility of erythrocytes in German blood donors: screening using a modified glycerol lysis test. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
2. Tse WT, Lux SE. Red blood cell membrane disorders. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
3. Gallagher PG. Red cell membrane disorders. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein defect. Haematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
5. Hematology of infancy and childhood. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. Die osmotische Resistenz (Fragilität) von menschlichen Erythrozyten. J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
7. Gottfried EL, Robertson NA. Glycerol-Lysezeit von inkubierten Erythrozyten in der Diagnose der hereditären Sphärozytose. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: a screening test for spherocytosis. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. Ein neuer Test für die Labordiagnose der Sphärozytose. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Erythrozytenanomalien bei hereditärer Sphärozytose: Bedeutung für die Diagnose und das Verständnis der unterschiedlichen Ausprägung des klinischen Schweregrads. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Hereditäre Sphärozytose. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. Eine prospektive Studie zur Bewertung des prädiktiven Werts für hereditäre Sphärozytose unter Verwendung von fünf Labortests (Kryohämolysetest, Eosin-5′-Maleimid-Durchflusszytometrie, osmotischer Fragilitätstest, Autohämolysetest und SDS-PAGE) bei 50 Familien mit hereditärer Sphärozytose in Argentinien. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
13. Korones D, Pearson HA. Normale osmotische Fragilität der Erythrozyten bei hereditärer Sphärozytose. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Diagnostic value of acidified glycerol lysis test (AGLT) in hereditary spherocytosis and selected hematologic diseases. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. Neue Tests für die Labordiagnose der Sphärozytose. Vnitr Lek. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Cryohemolysis test as a diagnostic tool for hereditary spherocytosis. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
17. Streichman S, Gescheidt Y. Cryohemolysis for the detection of hereditary spherocytosis: correlation studies with osmotic fragility and autohemolysis. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anaemia. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Using the eosin-5-maleimide binding test in the differential diagnosis of hereditary spherocytosis and hereditary pyropoikilocytosis. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. The mutant erythrocyte band 3 protein in Southeast Asian ovalocytosis does not bind eosin-5-maleimide. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Detection of hereditary pyropoikilocytosis by the eosin-5-maleimide (EMA)-binding test is attributable to a marked reduction in EMA-reactive transmembrane proteins. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Experience with eosin-5′-maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Durchflusszytometrie als diagnostisches Hilfsmittel bei hereditärer Sphärozytose. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Usefulness of the eosin-5′-maleimide cytometric method as a first-line screening test for the diagnosis of hereditary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Bewertung des durchflusszytometrischen Eosin-5-Maleimid-Tests bei der Diagnose der hereditären Sphärozytose. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Flowcytometric diagnostics of hereditary spherocytosis. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. Reliability of EMA binding test in the diagnosis of hereditary spherocytosis in Italian patients. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Rapid flow cytometric test using eosin-5-maleimide for diagnosis of red blood cell membrane disorders. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding to band 3 and Rh-related proteins forms the basis of a screening test for hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. In vitro quantification of anti-red blood cell antibody production in idiopathic autoimmune haemolytic anaemia: effect of mitogen and cytokine stimulation. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
32. Dacie JV, Lewis SM. Practical Haematology. Churchill Livingston: London; 2001. Google Scholar
33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. Die Herstellung und die chemischen Eigenschaften von hämoglobinfreien Geistern menschlicher Erythrozyten. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
35. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
36. Beutler E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
37. Iolascon A, Avvisati RA. Genotyp/Phänotyp-Korrelation bei hereditärer Sphärozytose. Haematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Usefulness of cryohemolysis test in the diagnosis of hereditary spherocytosis. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Kontrolle der lateralen und rotatorischen Mobilität von Band 3 durch Band 4.2 in intakten Erythrozyten: Freisetzung von Band 3-Oligomeren aus Bindungsstellen mit geringer Affinität. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. Does preincubation of the red blood cells contribute to the capability of the osmotic fragility test to detect very mild forms of hereditary spherocytosis? Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
41. Praktische Hämatologie. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Erfahrungen mit dem Glycerin-Lyse-Test in saurem Medium bei der Diagnose der hereditären Sphärozytose. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Diagnostischer Nutzen des vorinkubierten angesäuerten Glycerin-Lysetests bei hämolytischen und nicht-hämolytischen Anämien. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Vergleich von angesäuertem Glycerin-Lysetest, Pink-Test und osmotischem Fragilitätstest bei hereditärer Sphärozytose: Auswirkung der Inkubation. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. An evaluation of the acidified glycerol lysis test. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Congenital dyserythropoietic anemia type II (CDA II) mimicking hereditary spherocytosis (HS): report of 12 cases detected by SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar