Effiziente Produktion von 3-Hydroxypropionsäure aus Glycerin durch metabolisch veränderte Klebsiella pneumoniae

Bei der Produktion von 1,3-Propandiol oder 3-HP aus Glycerin ist Milchsäure das Hauptnebenprodukt, das die Produktausbeute erheblich verringert. Daher wurde versucht, die Laktatproduktion durch Deletion des Gens, das für Laktatdehydrogenase kodiert, zu reduzieren (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Da die beiden Reaktionen, bei denen 1,3-Propandiol und 3-HP gebildet werden, um ihr gemeinsames Substrat 3-Hydroxyaldehyd (3-HPA) konkurrieren, begünstigt die Deletion der Propandiol-Oxidoreduktase die 3-HP-Produktion (Ashok et al. 2011). Daher wurden in dieser Studie die Gene ldhA und dhaT ausgeschaltet, um die 3-HP-Produktion zu steigern.

Auswirkung des ldhA-Mangels auf die 3-HP-Produktion

Der ldhA-defiziente Stamm JJQ01 wurde konstruiert und der Knockout von ldhA wurde bestätigt, wie in Abbildung S2A gezeigt. Die rekombinanten Stämme Kp4(pUC18-kan-aldH) und JJQ01(pUC18-kan-aldH) wurden konstruiert und in einem 5-L-Bioreaktor im Fed-Batch-Verfahren fermentiert. Die Profile des Zellwachstums, des Glycerinverbrauchs und der Metabolitenproduktion sind in Abb. 2a, b dargestellt. Kp4(pUC18-kan-aldH) produzierte 18,3 g/L 3-HP mit einer Ausbeute von 0,21 mol/mol in 38 h, während die Milchsäure 32,2 g/L mit einer höheren Ausbeute von 0,34 mol/mol erreichte. Darüber hinaus wurden 17,6 g/L 2,3-Butandiol, 6,1 g/L 1,3-Propandiol und 10,7 g/L Essigsäure produziert. Die Bildung von Laktat erhöht nicht nur die Kosten, sondern erschwert auch die Gewinnung von 3-HP, das ein Isomer von Laktat ist. Außerdem ist Laktat ein Hauptinhibitor der Biosynthese von 3-HP und 1,3-Propandiol (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Durch den Mangel an ldhA wurde die Laktatbildung wirksam unterbunden und die 3-HP-Produktion erreichte 48,3 g/L mit einer Ausbeute von 0,28 mol/mol, wie in Abb. 2b gezeigt. Die Konzentration und der Ertrag von 3-HP in diesem ldhA-defizienten Stamm waren im Vergleich zum Kp4(pUC18-kan-aldH)-Stamm um das 1,64-fache bzw. 33,3 % erhöht. Abgesehen von der geringen Ethanolbildung (ca. 4 g/L) wurde die Akkumulation von Pyruvat und Formiat durch den ldhA-Mutantenstamm nicht festgestellt, was bei der Verwendung des Wildtyp-Stammes fast nicht der Fall war.

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Blockierung der Milchsäureproduktion den Kohlenstofffluss stark auf die 3-HP-Produktion umleitet. Die Assimilation von Glycerin durch DhaB wurde deutlich verbessert, fast 0,4 mol/mol Glycerin wurden durch DhaB zu 3-HPA geleitet, was mit anderen Studien übereinstimmt (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). Die Verringerung von Laktat konnte die Toxizität für die Zellen verringern, das Zellwachstum und die Produktivität von 3-HP begünstigen. Die Reduzierung von Laktat erhöhte jedoch auch die Bildung von 2,3-Butandiol und 1,3-Propandiol, die 21,9 g/L mit einem Ertrag von 0,13 mol/mol bzw. 18,5 g/L mit einem Ertrag von 0,12 mol/mol erreichten. Aufgrund der ldhA-Deletion könnte überschüssiges NADH aus der erhöhten 3-HP-Akkumulation die Produktion von 2,3-Butandiol und 1,3-Propandiol anstelle von Laktat fördern, um NAD+ zu regenerieren und das Redox-Gleichgewicht zu erhalten. Tatsächlich unterstützte die Bildung von Ethanol auch die Regeneration von NAD+, was zu einem höheren Fluss von Pyruvat zu Ethanol führte als der Fluss zu Pyruvat.

Auswirkung von dhaT-Mangel auf die 3-HP-Produktion

Die Deletion von ldhA steigerte die 3-HP-Produktion dramatisch, gleichzeitig wurde auch die 1,3-Propandiol-Produktion auf 18,5 g/L erhöht. Ko et al. (2017) berichteten, dass 43 g/L 3-HP und 21 g/L 1,3-Propandiol durch Reduktion von Acetat und anderen Nebenprodukten gewonnen wurden. Obwohl die Bildung von 1,3-Propandiol die Glycerinverwertung durch die Regeneration von Cofaktor begünstigt, macht sie einen erheblichen Teil des Glycerin-Kohlenstoffflusses aus. Da 1,3-Propandiol und 3-HP um dieselbe Vorstufe 3-HPA konkurrieren, wurde der ldhA- und dhaT-Doppelknockout-Stamm (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH) konstruiert, um den Fluss zu 1,3-Propandiol zu begrenzen. Die Ergebnisse der Fed-Batch-Fermentation im 5-L-Reaktor sind in Abb. 2c dargestellt. Unerwarteterweise führte der gleichzeitige Knockout von ldhA und dhaT nur zu 44,5 g/L 3-HP, obwohl die Ausbeute auf 0,32 mol/mol Glycerin erhöht wurde. Die Deletion von dhaT führte zu einer Verringerung des 1,3-Propandiol-Titers und der Ausbeute auf 9,9 g/L bzw. 0,07 mol/mol. Bei der von YqhD und anderen Oxidoreduktasen katalysierten Reaktion wurde jedoch weiterhin 1,3-Propandiol gebildet (Ashok et al. 2013). Darüber hinaus war die 2,3-Butandiol-Produktion im Vergleich zu JJQ01(pUC18-kan-aldH) von 21,9 auf 23,4 g/L leicht erhöht, was darauf hindeutet, dass der Fluss zum 2,3-Butandiol-Weg erhöht wurde, um das überschüssige NADH aus der ALDH-katalysierten Reaktion zu verbrauchen. Die 1,3-Propandiolsynthese spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Redoxgleichgewichts in K. pneumoniae. Im Rahmen des Oxidationsweges werden bei der Bildung von einem Molekül Acetat aus Glycerin drei Moleküle NADH und gleichzeitig ein Molekül ATP gebildet. Folglich verringerte die Deletion von ldhA und dhaT die Fähigkeit zur NAD+-Regeneration erheblich, und es wurde mehr NADH durch die Bildung von 2,3-Butandiol oxidiert, was zu einem Anstieg von 2,3-Butandiol führte. Eine Verringerung der Belüftungsrate (Begrenzung der Sauerstoffzufuhr) konnte die Acetatproduktion erhöhen, um mehr ATP bereitzustellen, aber gleichzeitig wurde mehr NADH gebildet, was zu einer weiteren Erhöhung der 2,3-Butandiolproduktion führte. Das regenerierte NAD+ schien jedoch geringer zu sein als das bei der durch DhaT katalysierten Reaktion gebildete, was zu einer geringeren 3-HP-Produktion führte. Daher ist die Bereitstellung einer geeigneten Menge an Sauerstoff zur Erzeugung von NAD+ ohne Beeinträchtigung der DhaB-Aktivität und der Glycerin-Dissimilation entscheidend für die 3-HP-Produktion in der mikro-aeroben Fermentation.

In dieser Studie ist es nicht gelungen, die 3-HP-Produktion durch Deletion des dhaT-Gens zu verbessern. Die Glycerin-Dissimilation wird durch die Glycerin-Dehydrogenase DhaD, die Glycerin-Kinase GlpK, die Glycerin-Dehydratase DhaB und die 1,3-Propandiol-Oxidoreduktasen 1,3-PDORs reguliert. Die Starrheit der Glycerinverzweigung bedeutet, dass eine Verbesserung der 3-HP-Produktion durch Deletion von Genen, die an der Verteilung des Glycerinflusses beteiligt sind, schwierig ist. Ashok et al. (2011) hatten die inhärenten Aktivitäten von DhaD, DhaB, ALDH und 1,3-PDORs nach Deletion des dhaT-Gens bestimmt. Sie fanden heraus, dass sich die Aktivität von DhaD leicht verbesserte, die Aktivität von ALDH leicht abnahm und die Aktivität von DhaB deutlich sank. Zhang et al. (2008) analysierten auch die Robustheit an Verzweigungspunkten des Glycerindissimilationswegs. Es zeigte sich, dass die Aufteilung des Kohlenstoffflusses zwischen dem reduktiven und dem oxidativen Zweig robust gegenüber den Umweltbedingungen war.

Auswirkung der Belüftung auf die 3-HP-Produktion

Unsere früheren Studien zeigten, dass mikro-aerobe Bedingungen für die 3-HP-Produktion günstig waren. Im Vergleich zum anaeroben Prozess wurde bei der mikro-aeroben Fermentation die 3-HP-Produktion aufgrund der höheren Expressionsrate der Aldehyd-Dehydrogenase signifikant erhöht, während gleichzeitig die 1,3-Propandiol-Produktion reduziert wurde (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) berichteten, dass die spezifische Aktivität der Glycerin-Dehydratase in K. pneumoniae bei einer Belüftungsrate von 0,04 vvm um 59 % höher war als bei fehlender Luftzufuhr. Es wurde jedoch berichtet, dass Glycerin-Dehydratase schnell durch Sauerstoff inaktiviert werden kann (Toraya 2000; Ruch und Lin 1975) und die 3-HP-Produktion erheblich beeinträchtigt (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Außerdem wird Coenzym B12, der Cofaktor für DhaB, unter hohen Belüftungsbedingungen in den meisten natürlichen 3-HPA-Produzenten wie K. pneumoniae nicht ausreichend synthetisiert. Huang et al. (2013) und Ko et al. (2017) zeigten ebenfalls, dass hoch aerobe Bedingungen für die 3-HP-Produktion nicht förderlich sind. Daher führten wir vorläufige Fed-Batch-Experimente unter verschiedenen Belüftungsbedingungen durch und stellten fest, dass die Aufrechterhaltung einer hohen Belüftungsrate für die 3-HP-Produktion ungünstig war, nachdem das Zellwachstum eingestellt wurde (Daten nicht gezeigt). Bei der Fed-Batch-Kultur von JJQ02(pUC18-kan-aldH) nahmen wir eine Belüftungsrate an, die halb so hoch war wie die anfängliche Rate, als die OD650 auf den Maximalwert geschlossen wurde. Die Profile von Wachstum, Glycerin und Metaboliten sind in Abb. 3 dargestellt, und der schwarze Pfeil zeigt den Zeitpunkt an, zu dem die Belüftungsrate gesenkt wurde (0,5 vvm).

Der Endtiter von 3-HP erreichte 61.9 g/L mit einer Ausbeute von 0,58 mol/mol im 5-L-Reaktor in 38 h. Die 3-HP-Konzentration und -Ausbeute von JJQ02(pUC18-kan-aldH) waren 3,3- und 2,76-mal höher als die von Kp4 (pUC18-kan-aldH) und 1,28- und 2,07-mal höher als die von JJQ01(pUC18-kan-aldH). Die Ergebnisse zeigten, dass die Produktion von 1,3-Propandiol und 2,3-Butandiol nach 20 Stunden aufhörte. Der Titer von 3-HP stieg jedoch weiter an, obwohl die Produktionsrate ab diesem Zeitpunkt abnahm. Im späteren Teil der mikroaerobischen Fermentation wurde zwar nur wenig NADH durch die Bildung von 1,3-Propandiol und 2,3-Butandiol regeneriert, aber ein Teil des NADH konnte immer noch über die Elektronentransportkette regeneriert werden, da der effizienteste Weg zur Regeneration von NAD+ über die Elektronentransportkette in Gegenwart von Sauerstoff führt (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), was zu einem Anstieg von 3-HP ohne offensichtlichen Anstieg von 1,3-Propandiol und 2,3-Butandiol führt.

300-L-Scale-up-Fermentation

Um die Durchführbarkeit des Stammes JJQ02(pUC18-kan-aldH) für die 3-HP-Produktion in einem größeren Bioreaktor zu untersuchen, wurde eine Fed-Batch-Fermentation in einem 300-L-Bioreaktor unter den im 5-L-Fermenter etablierten Fermentationsbedingungen durchgeführt. Es wurde eine zweistufige Belüftungsstrategie angewandt; die Belüftungsrate wurde zum Zeitpunkt des schwarzen Pfeils auf die Hälfte gesenkt, wie in Abb. 4 gezeigt. 3-HP erreichte 54,5 g/L mit einer Ausbeute von 0,43 mol/mol, und die Konzentration und Ausbeute betrugen 12,2 g/L und 0,11 mol/mol für 1,3-Propandiol, 21,3 g/L und 0.17 mol/mol für 2,3-Butandiol und 9,3 g/L und 0,11 mol/mol für Acetat in 51 h (Abb. 4).

Im Vergleich zu den Ergebnissen, die im 5-L-Reaktor erzielt wurden, waren der Titer und die molare Ausbeute von 2,3-Butandiol im 300-L-Reaktor deutlich erhöht, die denen mit der gleichen Belastung im 5-L-Reaktor bei einer konstanten Belüftungsrate von 1 vvm ähnlich waren. Dies deutet darauf hin, dass der Sauerstofftransfer im 300-L-Reaktor etwas höher sein könnte als im 5-L-Reaktor mit reduzierter Belüftungsrate, da einige Untersuchungen darauf hingewiesen haben, dass die Produktion von 2,3-Butandiol eine geeignete Belüftungsrate erfordert (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Unter den Belüftungsbedingungen im 300-L-Reaktor förderte die Expression der Enzyme, die mit der 2,3-Butandiolbildung und dem NADH-Pool oder dem NADH/NAD+-Verhältnis in Verbindung stehen, die 2,3-Butandiolproduktion, und die Expression von DhaB und AldH könnte leicht beeinträchtigt sein.

Im Hinblick auf das Redox-Gleichgewicht wurde im ldhA-dhaT-Doppelmutantenstamm das in der durch ALDH katalysierten Reaktion gebildete NADH teilweise durch die Bildung von 2,3-Butandiol und anderen reduzierten Metaboliten wie Ethanol und Succinat und teilweise durch die Elektronentransportkette regeneriert (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Daher wirkte sich die Belüftungsrate bei der Mikrobelüftungsfermentation erheblich auf die Endprodukte aus. Bei der Fermentation im 300-Liter-Reaktor wurde die Belüftungsrate zwar auf die Hälfte der anfänglichen Rate reduziert, aber die Sauerstofftransfersituation könnte sich aufgrund der unterschiedlichen Sauerstofftransfereigenschaften immer noch stark von der im 5-Liter-Reaktor unterscheiden, was ein traditionelles Thema beim Scale-up von Bioprozessen ist. Die Unterschiede in der Produktverteilung in den verschiedenen Reaktoren wiesen darauf hin, wie wichtig eine genaue Steuerung der Sauerstoffzufuhr ist, während eine bloße Reduzierung der Belüftungsrate zu grob erschien. Obwohl der 3-HP-Titer und die Ausbeute leicht von denen im 5-L-Reaktor abwichen, war das Scale-up erfolgreich. Da sich die Leistung des Sauerstofftransfers im 300-L-Reaktor von der des 5-L-Reaktors unterschied, wurde erwartet, dass eine weitere präzise Regulierung der Belüftungsrate im 300-L-Reaktor den 3-HP-Gehalt erhöhen könnte.