Ein RNA-produzierendes DNA-Hydrogel als Plattform für ein hochleistungsfähiges RNA-Interferenzsystem

Synthese und Charakterisierung des I-Gels

Die vier Oligonukleotide der X-DNA (X01-X04 DNA-Stränge) wurden kommerziell von Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA) synthetisiert. Die X-DNA-Sequenzen (ergänzende Tabelle 5) wurden nach denselben Verfahren entwickelt, hergestellt und charakterisiert, wie sie in der Literatur mit leichten Änderungen beschrieben sind10,13. Lyophilisierte DNA-Stränge im Maßstab 1 μmol wurden durch Zentrifugation bei 14.000 g für 15 s bei Raumtemperatur gesammelt. Jeder DNA-Strang wurde in 1,0 mM Konzentration in 1x TE-Puffer (pH 8,0) resuspendiert. Jedes Röhrchen wurde geschüttelt und mit MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) bei 1500 U/min für ~3 h gemischt, um die lyophilisierten Oligonukleotide vollständig aufzulösen. Insgesamt wurden 0,05 μmol (50 μl) jedes DNA-Strangs in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben und nukleasefreies Wasser hinzugefügt, so dass das Gesamtvolumen der Oligonukleotidmischung 500 μl betrug. 100 μl der Oligonukleotidmischung wurden in 0,5-ml-Röhrchen verteilt. Die Röhrchen wurden in einen Thermocycler (Bio-Rad, CA, USA) gestellt. Die vier Oligonukleotidtypen (X01 ~04) wurden unter folgenden Bedingungen annealed: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 min; und 65 °C für 2 min, 60 °C für 5,5 min, Absenkung um 1 °C unter Beibehaltung von 1 min bei dieser Temperatur, 20 °C für 30 s, und Absenkung auf 4 °C zur Stabilisierung und Lagerung der X-DNA. Für den Pufferaustausch wurde die getemperte X-DNA-Lösung (500 μl) in einer Filtereinheit (3-kDa-MW-Cutoff) für die Mikrozentrifugation 6 Stunden lang bei 15 000 g und 4 °C zentrifugiert, um das Lösungsmittelvolumen zu reduzieren. Die Filtereinheit wurde in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführt. Insgesamt wurden 100 μl nukleasefreies Wasser bei 4 °C in die Filtereinheit gegeben. Die Filtereinheit wurde 4 Stunden lang bei 15.000 g und 4 °C zentrifugiert, um die X-DNA von den restlichen Salzen zu befreien. Das abgeschnittene Filtermodul wurde mit dem Kopf nach unten in das Röhrchen gelegt und bei 2000 g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Zugabe von nukleasefreiem Wasser und die Zentrifugation wurden zwei weitere Male in demselben Zentrifugenröhrchen durchgeführt, um das restliche Salz der X-DNA vollständig zu entfernen. Das Endvolumen der X-DNA-Lösung beträgt ~300 μl. Das siRNA-Expressionsplasmid (I-Plasmid) wurde von Cosmo Genetech (Seoul, Südkorea) erworben und maximal aufbereitet. Zur Herstellung der I-Gele wurden die I-Plasmide mit Hilfe des Restriktionsenzyms BamHI linearisiert. Die Größe des siRNA-Gens betrug 66 bp mit dem Spacer (oder 498 bp mit dem T7-Promotor) (siehe ergänzende Abbildung 4 für die I-Plasmidkarte). Die DNA-Mengen der Proben wurden anhand ihres UV/Vis-Absorptionswertes mit einem BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bestimmt. Die X-DNA und die linearen Plasmide wurden zunächst in einem vorgegebenen molaren Verhältnis in Gegenwart von T4-DNA-Ligase (Promega, Madison, WI, USA) gemischt, um das Dgel zu synthetisieren. Für ein X-DNA:I-Plasmid-Verhältnis von 1500:1 verwendeten wir 10,5 μL 75 μM X-DNA und 5,25 μL 100 nM Plasmid in einem Reaktionsvolumen von 30 μL. Für das Blank-Gel-Experiment wurde die gleiche Menge an X-DNA-Material wie im I-Gel mit T4-DNA-Ligase ligiert. 10 µL jeder Probe wurden mit 2 µL Gelladepuffer gemischt und auf einem 0,7- oder 2-prozentigen Agarosegel bei 100 V für 60 Minuten elektrophoretisch gelagert. Alle DNAs (X-DNA, I-Plasmid, Blank-Gel und I-Gel) wurden durch Agarosegelelektrophorese bestätigt (ergänzende Abbildungen 3, 11, 18). Die synthetisierten D-Gele wurden zweimal mit Amicon 3-kDa Mw Cutoff Mikrotubus-Zentrifugalfiltern entsalzt. Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden die Proben in einem FreeZone-Gefriertrockner (Labconco, Kansas City, MO, USA) gefriergetrocknet, bis das gesamte Wasser entfernt war. Die getrockneten Proben wurden geknackt, um ihre frischen Oberflächen freizulegen. Nachdem sie mit einer 2~ 3-nm-Pt-Schicht für 100 s sputterbeschichtet worden waren, wurde die Morphologie dieser Hydrogeloberflächen mit einem S-3500N (Hitachi, Tokio, Japan) Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV bei ~50.000-facher Vergrößerung beobachtet (ergänzende Abbildung 19).

I-Gel-Stabilitätstest

Sieben Proben wurden jeweils für das freie I-Plasmid und das I-Gel hergestellt. In jeder Probe wurden 2 µL des freien I-Plasmids (57 ng) oder des I-Gels (1:1500 Gel mit 57 ng I-Plasmid) in 12 µL destilliertem Wasser verdünnt, dann wurden 4 µL transkriptionsoptimierter 5 × Puffer hinzugefügt und mit 3,33 × 10-5 Einheiten DNase I (Nr. M6101; Promega) auf 20 µL Endvolumen behandelt, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 0, 1, 4, 12, 24 und 48 h. Nach der Inkubation wurden die 20-µl-Proben in zwei 10-µl-Aliquots aufgeteilt, eines für die Elektrophorese und eines für die anschließende Transkription. In jedem Aliquot wurde die Denaturierungsreaktion durch Zugabe von 1 µL RQ1-DNase-Stop-Lösung und Inkubation für 10 min bei 65 °C beendet. Danach wurden 10 µL jeder Probe mit 2 µL Gelladepuffer gemischt und auf einem 2%igen Agarosegel bei 100 V für 60 min elektrophoretisiert (ergänzende Abbildung 13). Ein weiteres Aliquot jeder Probe wurde für die Transkriptionsreaktion verwendet, um die Transkriptionseffizienz von I-Gel nach der Verdauungsreaktion zu demonstrieren. shRNAs wurden von den I-Gel- oder freien I-Plasmidvorlagen (0, 24, 48 h) unter Verwendung des Transkriptionskits (Riboprobe; Promega) gemäß der Anleitung des Herstellers transkribiert. Die erhaltenen shRNAs wurden durch RT-qPCR quantifiziert, wie in den Abschnitten „Vorbereitung der Gesamt-RNA“ und „Reverse Transkription“ und „Echtzeit-PCR und Datenanalyse“ beschrieben (ergänzende Tabelle 4).

Expressions- und Inhibitionsanalysen von Proteinen

Gekoppelte Transkriptions- und Translationskits (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, Katalognummer 88882) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) erworben, und die Reaktionen wurden nach den vom Hersteller vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt wurden das HeLa-Zelllysat, die akzessorischen Proteine, der Reaktionsmix und das pcDNA3.1( + ) IRES GFP-Plasmid (0,5 μg/μL; Nr. 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) in einem 12,5:2.5:5:2 (v/v) gemischt und bei 30 °C für 1, 2, 4 und 6 h inkubiert. Nach den angegebenen Reaktionszeiten wurden die Probenlösungen für 24 h bei 4 °C inkubiert, um die Reaktion zu stoppen und eine ausreichende Proteinfaltung zu gewährleisten. Zur Bewertung der Interferenzeffizienz wurde dem Zelllysat freies I-Plasmid oder I-Gel in Gegenwart von 1000 ng GFP-Plasmid zugesetzt. In den Kontrollexperimenten für die optimierte I-Gel-Bedingung mit 57 ng I-Plasmid (17,5 nmol), verschlüsselter shRNA (17,5 nmol und 1,75 μmol; 1 Äquivalent bzw. 100 Äquivalente zur Menge des I-Plasmids) (SN-1003; Bioneer, Seoul, Korea), verschlüsselter Plasmidmischung (17.5 nmol; verschlüsselte shRNA-Expressionsplasmidmischung; Cosmo Genetech), verschlüsseltes Plasmidgel (verschlüsselte Plasmidmischung, die enzymatisch mit X-DNA vernetzt ist), die I-Gel-Komponente (nur X-DNA, nur I-Plasmid oder diese Mischung ohne enzymatische Vernetzung; d. h. keine Gelbildung) oder Blank-Gel (nur enzymatische Vernetzung von X-DNAs) wurden direkt zur GFP-Expressionsreaktionslösung hinzugefügt. Alle Reaktionen wurden mindestens dreimal durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurde das Reaktionsvolumen auf 25 μl gehalten. Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem Spektrofluorophotometer (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seoul, Korea) analysiert, um das Niveau der GFP-Expression in der Zelllysatlösung zu bestimmen.

Gesamt-RNA-Vorbereitung und reverse Transkription

Als Spike-in-Kontrolle wurden 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL; Nr. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Kanada) zu allen vorexprimierten Zelllysaten (20 µL) vor der RNA-Extraktion hinzugefügt. Anschließend wurde die Gesamt-RNA aus 23 µl des Lysats mit TRIzol-Reagenz (Ambion, Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die extrahierte Gesamt-RNA wurde in 10 µL DEPC-behandeltem Wasser (Ambion, Thermo Fisher Scientific) aufgelöst. Anschließend wurden 2 µL der Gesamt-RNA mit 1 mM ATP in 1 × poly(A)-Polymerasepuffer mit 5 U Escherichia coli poly(A)-Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) bei 37 °C für 30 min in einer 20 µL-Reaktionsmischung polyadenyliert. Für die reverse Transkription wurden 4 µL der geschwänzten RNA mit 1 pmol RT-Primer und 0,5 mM dNTP-Mischung vermischt und dann mit DEPC-behandeltem Wasser auf ein Volumen von 13 µL aufgefüllt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 65 °C erhitzt und dann schnell auf Eis abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde dann durch Zugabe von 5 mM Dithiothreitol, 1 × Erststrangpuffer, 40 U RNase-Inhibitor und 200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) auf ein Endvolumen von 20 µL aufgefüllt und 1 h bei 50 °C inkubiert, gefolgt von einer 15-minütigen Enzyminaktivierung bei 70 °C. Die RT-Primer-Sequenzen (siehe ergänzende Tabelle 5) wurden für die Synthese von cDNA aus der RNA-Sequenz entworfen. Der verwendete Primer war der 3′-RACE-Adapter, der im FirstChoice RLM-RACE-Kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) enthalten ist. Alle Primer wurden von Cosmo Genetech synthetisiert, mit Ausnahme des cel-miR-39-Vorwärtsprimers (Norgen Biotek Corp.). Die Wiederfindungsrate der RNA in jeder Lysatlösung wurde anhand der Differenz zwischen dem CT-Wert der erhaltenen Spike-in-Kontrolle und dem der Referenz cel-miR-39 (ohne Extraktionsprozess) geschätzt.

Echtzeit-PCR und Datenanalyse

Die Mengen an shRNA und GFP-mRNA wurden durch qPCR mit dem StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) quantifiziert. Die qPCR jeder Probe wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µL mit 2 µL cDNA, 10 µL von 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) und 10 pmol jedes Primers durchgeführt. Die Amplifikation wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 min; und 30 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s. Die qPCR wurde auch mit cel-miR-39 als Referenz-RNA durchgeführt, um die Wiederfindungsrate der Gesamt-RNA in jeder Probe zu erhalten. Das qPCR-Protokoll war dasselbe wie das oben in diesem Abschnitt beschriebene, mit Ausnahme der verwendeten Primer, die 10 pmol eines gemeinsamen Reverse-Primers (derselbe wie der shRNA-Reverse-Primer) und cel-miR-39-Vorwärtsprimer waren. Die Schmelzkurve jedes amplifizierten DNA-Produkts wurde durch Messung der Fluoreszenzintensitätsänderung des SYBR-Grün-Farbstoffs sechsmal pro Probe ermittelt, während die Temperatur nach Abschluss der qPCR mit einer Rate von + 0,3 °C/s von 60 °C auf 95 °C erhöht wurde. Die spezifischen Primer für die qPCR wurden mit dem Primer3-Programm (http://primer3.ut.ee/) entworfen (ergänzende Tabelle 5). Die relative Expression der Targets wurde mit Hilfe der vergleichenden 2-ΔΔCT-Methode bestimmt. Die relative Menge der GFP-mRNA wurde auch durch Messung der Bandenintensität auf dem 2%igen Agarosegel bestätigt. Die Amplifikation der cDNA wurde mit den gleichen PCR-Bedingungen und dem gleichen Programm wie bei der oben beschriebenen qPCR durchgeführt, mit Ausnahme der PCR-Zykluszahl (20 für GFP mRNA).

Kalibrierung und Quantifizierung der absoluten RNA-Menge

Standardkurven für die RNA-Konzentration und den CT-Wert wurden unter Verwendung jedes RNA-Standardmaterials erstellt. Für die shRNA wurde die Standardkurve unter Verwendung von synthetisierten shRNAs erstellt, die von Integrated DNA Technologies erworben wurden. Für die GFP-mRNA wurde die Kurve unter Verwendung der GFP-mRNA erstellt, die mit einem Transkriptionskit (Riboprobe; Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert wurde. Die RNA-Menge der Standard-shRNA wurde von Integrated DNA Technologies mitgeteilt, während die der extrahierten Standard-GFP-mRNA anhand ihres UV/Vis-Absorptionswertes mit dem BioSpectrometer bestimmt wurde. Die erhaltenen Standard-RNAs wurden durch reverse Transkription in cDNA umgewandelt, wie oben im Abschnitt „Vorbereitung der Gesamt-RNA und reverse Transkription“ beschrieben. Danach wurde die cDNA 10-, 100-, 1000- und 10.000-mal verdünnt und die qPCR dreimal wiederholt, und die erhaltenen CT-Werte wurden zur Erstellung einer Standardkurve verwendet. Die aus der RT-qPCR erhaltenen CT-Werte wurden durch ein Kalibrierungsverfahren in die anfänglichen RNA-Konzentrationen in den Zelllysaten umgerechnet (ergänzende Abbildung 6). Die endgültige absolute RNA-Menge wurde durch Multiplikation jeder RNA-Wiederfindungsrate (%) mit dem Wert der RNA-Menge aus der Kalibrierungskurve bestimmt (ergänzende Tabellen 1, 2).

Zelluläre Markierung mit Cy5-I-Gel

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen wurden von der Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea) bezogen und in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin in einem befeuchteten und mit CO2 (5 %) gefüllten Inkubator gehalten. Die MDCK-Zellen, die GFP (MDCK-GFP) exprimieren, wurden durch Transfektion des pEGFP-N1-Vektors mit Lipofectamine-Reagenzien (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Herstellerprotokoll hergestellt. Anschließend sortierten wir die GFP-emittierenden Zellen mit dem FACSCanto II System (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Während der gesamten Untersuchung wurden die Zellen negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet. In 24-Well-Platten mit Deckgläsern kultivierte MDCK-GFP-Zellen (50 000 Zellen pro Vertiefung) wurden mit dem Cy5-I-Gel (Cy5-konjugiertes I-Gel), das Cy5-konjugierte X01-DNA-Sequenzstränge (entsprechend 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) enthielt, in serumfreiem Medium 4 Stunden lang inkubiert. Zur Herstellung des Cy5-I-Plasmids wurde zunächst Cy5-dsDNA (Cy5-konjugierte dsDNA) durch Annealing von Cy5-konjugiertem X01 (mit einem zusätzlichen 5′-p-GATC-Sticky-End) und seinem komplementären Gegenstrang (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′) hergestellt. Anschließend wurden die Cy5-dsDNA und das I-Plasmid gemischt und in einem molaren Verhältnis von 5000:1 ligiert. Überschüssige, nicht gebundene Cy5-dsDNA wurde durch 4-5maliges Zentrifugieren (12 400 g, 4 °C, 60 min) mit Amicon-Mikroröhrchen-Zentrifugalfiltern (50 kDa Mw cutoff) entfernt. Die Cy5-shRNA (Cy5-konjugierte shRNA) wurde kommerziell synthetisiert (Integrated DNA Technologies). Für die Cy5-I-Plasmid- und Cy5-shRNA-Sets wurden die Zellen 4 Stunden lang mit 2,625 nM jeder Probe in serumfreiem Medium inkubiert. Für die Lipofectamin-Cy5-I-Plasmid- und Lipofectamin-Cy5-shRNA-Sets wurden Lipofectamin und die Cy5-konjugierte Probe elektrostatisch komplexiert, indem sie in einem molaren Verhältnis von 1:1 bis zu einer endgültigen Lösungskonzentration von 2,625 μM Lipofectamin und 2,625 μM Substrat gemischt wurden. Anschließend wurden die Zellen mit dem 2,625 μM Lipofectamine-Cy5-I-Plasmid bzw. Lipofectamine-Cy5-shRNA in serumfreiem Medium 4 Stunden lang inkubiert. Im Falle der reinen Zellkontrolle wurden die Zellen mit serumfreiem DMEM mit 1 % (v/v) Penicillin (HyClone) inkubiert. Nach 4 Stunden Koinzubation wurden alle Proben zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,1 M, pH 7,4) gewaschen, und die Zellen wurden weitere 6 Stunden in einem Wachstumsmedium mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS; HyClone) und 1 % Penicillin bebrütet, um eine ausreichende zelluläre Erholung und Aufnahmezeit zu gewährleisten. Die kultivierten Zellen wurden mit 4%igem Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und anschließend dreimal mit PBS-Puffer (0,1 M, pH 7,4) gewaschen. Für die mikroskopische Abbildung wurden Deckgläser mit den angehefteten Zellen auf Glasobjektträger montiert, wobei ein wässriges Montagemedium mit einem Antifadingmittel verwendet wurde. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zeiss Axioplan 2-Mikroskop aufgenommen, und die Bilder wurden mit einer Zeiss Axiocam HR-Kamera aufgenommen.

GFP-Gen-Silencing-Experiment mit dem I-Gel

Zunächst wurde das I-Gel, das 262,5 µM X-DNA und 175 nM I-Plasmid enthielt, mit 300 U T7-RNA-Polymerase (Thermo Fisher Scientific) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde die I-Gel-Probe in serumfreier DMEM mit 1 % Penicillin auf das 100-fache verdünnt. Dann wurde das 1/6-fache Volumen des I-Gel/Polymerase-Komplexes in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Deckglas gegeben, die für 24 h mit MDCK-GFP-Zellen (20 000 Zellen pro Vertiefung) vorbesetzt worden war. Für die I-Plasmid-, Scrambled-Plasmid-Mischung und die Scrambled-Plasmid-Gel-Sets wurden die MDCK-GFP-Zellen mit der gleichen molaren Menge jedes Plasmids und der T7-RNA-Polymerase wie im Falle des I-Gels kokultiviert. Zur Messung des RNAi-Effekts von nackter shRNA und Lipofectamine-shRNA wurde die 100-fache Menge jeder RNA-Probe im Verhältnis zur Anzahl der I-Plasmidvorlage verwendet, wobei die shRNA-Expressionsrate des I-Gels berücksichtigt wurde, wie sie aus dem Zelllysat-Experiment berechnet wurde. Für die nackten shRNA- und scrambled shRNA-Sets wurden MDCK-GFP-Zellen mit 175 nM der RNA-Probe koubiert. Die Lipofectamin-komplexierten Proben wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Für die Lipofectamine-I-Plasmid- und Lipofectamine-scrambled-Plasmid-Mischungen wurden Lipofectamine und jede Plasmidprobe elektrostatisch komplexiert, indem sie in einem molaren Verhältnis von 5:1 gemischt wurden, um eine endgültige Lösungskonzentration von 8,75 nM Lipofectamin und 1,75 nM Plasmidsubstrat zu erhalten. Für das Lipofectamin-shRNA-Set wurden Lipofectamin und freie shRNA elektrostatisch komplexiert, indem sie in einem molaren Verhältnis von 5:1 gemischt wurden, um eine endgültige Lösungskonzentration von 875 nM Lipofectamin und 175 nM shRNA zu erhalten. Die MDCK-GFP-Zellen wurden 4 Stunden lang mit den Lipofectamin-komplexierten Proben in serumfreiem Medium inkubiert. Für den reinen Zellsatz wurden nur die MDCK-GFP-Zellen 4 Stunden lang im serumfreien Medium inkubiert, ohne Proben. Alle Proben wurden nach der 4-stündigen Koinzubationszeit ausgewaschen, und die Zellen wurden zusätzlich 48 Stunden lang mit dem Wachstumsmedium (DMEM mit 10 % (v/s) FBS und 1 % Penicillin) inkubiert, um den RNA-Silencing-Effekt bei 37 °C und 5 % CO2 zu bewerten. Anschließend wurden die Zellen mit 4%igem Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und mit PBS-Puffer (0,1 M, pH 7,4) gewaschen. Für die mikroskopische Darstellung wurden die auf Deckgläsern fixierten Zellen mit wässrigem Einbettungsmedium und einem Antifadingmittel auf Glasobjektträger montiert.

Genexpressionsanalyse durch quantitative PCR in lebenden Zellen

Alle Proben wurden in jedem Zellmedium in der gleichen Menge und unter den gleichen Bedingungen wie im zuvor beschriebenen GFP-Gen-Silencing-Experiment unter Verwendung des I-Gel-Abschnitts behandelt und inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Zellmedium aus den Zellkulturplatten abgesaugt, und die MDCK-GFP-Zellen wurden einmal mit PBS-Puffer gewaschen und trypsiniert, um die Zellen in jeder Vertiefung der Platte abzulösen. Die abgelösten Zellen wurden mit PBS-Puffer verdünnt, um das Trypsin zu deaktivieren, und wurden dann in einem 1,5-mL-Mikroröhrchen gesammelt und durch Zentrifugation (180 g, 5 min) pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden mit 20 µL PBS-Puffer verdünnt. Die Zellsuspensionslösung (20 µL) wurde mit 1 mL TRIzol-Reagenz, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL) und 200 µL Chloroformlösung behandelt. Die anschließende RNA-Extraktion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zur Quantifizierung der relativen Menge an GFP-mRNA und shRNA auf zellulärer Ebene wurden alle qPCRs der Probenpräparate nach demselben Verfahren durchgeführt, wie in den Abschnitten „Vorbereitung der Gesamt-RNA und reverse Transkription“ und „Echtzeit-PCR und Datenanalyse“ beschrieben.

Zellbildanalyse zur Quantifizierung der Pixelintensität

Die Verarbeitung der Zellbilder erfolgte mit dem MATLAB-Programm (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). Die rohen Fluoreszenzbilder wurden in MATLAB importiert, und jedes Pixel in den Bildern wurde in jede Komponente der Matrix umgewandelt. Die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Komponenten wurde grafisch in einem Histogramm dargestellt. Der gesamte Datensatz wurde in 256 Intervalle unterteilt.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalyse

Die Zellen wurden einmal mit 1 ml PBS gewaschen und anschließend das Wachstumsmedium aus den Zellkulturplatten abgesaugt. Dann wurden die Zellen durch Trypsin-Behandlung von der Platte abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden in einem 15-mL-Röhrchen gesammelt und anschließend zu einem Pellet zentrifugiert (180 g, 3 min). Die überstehende Trypsinlösung wurde entfernt, und das Zellpellet wurde zweimal mit 2 mL PBS gewaschen. Die Zellen wurden in PBS resuspendiert, um eine Konzentration von 50 000 Zellen/ml zu erreichen. Dann wurden die Proben vorbereitet, indem die Zellen in einer 1%igen Formaldehydlösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert wurden. Die Proben wurden mit dem FACSCanto II System (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) auf die Intensität der GFP-Fluoreszenz analysiert.

Relative Lebensfähigkeit im Dunkeln

Eine MDCK-GFP-Zellsuspension (5000 Zellen pro Vertiefung) wurde in eine 96-Well-Platte (Corning Inc., Corning, NY, USA) gegeben und einen Tag lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nachdem sich die Zellen an die Platte geheftet hatten, wurden sie mit verschiedenen Konzentrationen des I-Gels (entsprechend der X-DNA-Konzentration) in dem Wachstumsmedium (DMEM mit 10 % (v/v) FBS und 1 % Penicillin) im Dunkeln inkubiert. Das I-Gel bestand aus einem molaren Verhältnis von X-DNA:I-Plasmid von 1500:1. Diese Proben wurden 6, 24 und 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 bebrütet. Am Ende jeder Inkubationszeit wurde den Proben Zellzählungs-Kit-8-Lösung (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubation von 1 Stunde wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Die Ergebnisse dieser Messung wurden als Verhältnis zwischen der Absorption der Probe und der Absorption der Negativkontrollzellen ohne Probeninkubation ausgedrückt.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der Software Prism 7.05 (GraphPad Software) für den Student’s t-Test, die einseitige ANOVA mit dem Bonferroni-Posttest für Mehrfachvergleiche durchgeführt. Der Holm-Bonferroni-Mehrfachvergleichs-Posttest wurde unter Verwendung der Ergebnisse des Bonferroni-Mehrfachvergleichs-Posttests von Prism 7.05 Software (GraphPad Software)30 durchgeführt. Der Normalitätstest wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test berechnet. Nach den Ergebnissen des Shapiro-Wilk-Tests waren die Daten annähernd normal verteilt. Statistische Signifikanz wird als *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 angegeben.