Die potenzielle Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in personalisierten Anwendungen der regenerativen Medizin kann durch Transgene erweitert werden, einschließlich der Expression von konstitutiven Zellmarkern, Differenzierungsreportern oder Modulatoren von Krankheitsphänotypen. Daher gibt es Präzedenzfälle für eine reproduzierbare Transgenexpression bei iPSC-Subklonen mit isogenem oder unterschiedlichem genetischem Hintergrund. Bei der Verwendung von Virus- oder Transposon-Vektoren sind die Integrationsstellen und die Kopienzahl der Transgene schwer zu kontrollieren, und es ist fast unmöglich, sie über mehrere Zelllinien hinweg zu reproduzieren. Darüber hinaus unterliegen zufällig integrierte Transgene häufig pleiotropen Positionseffekten als Folge epigenetischer Veränderungen, die mit der Differenzierung einhergehen, was Anwendungen in iPSCs untergräbt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir gängige TALEN- und CRISPR/Cas9-Nuklease-Technologien angepasst, um Transgene in vordefinierte Loci einzuführen und zufällige Positionseffekte zu überwinden. AAVS1 ist ein beispielhafter Locus innerhalb des PPP1R12C-Gens, der eine robuste Expression von CAG-Promotor-gesteuerten Transgenen ermöglicht. Das Gen-Targeting kontrolliert die Transgen-Kopienzahl, so dass die Reporter-Expressionsmuster reproduzierbar und um das ∼2-Fache skalierbar sind. Darüber hinaus wird die Genexpression während der langfristigen humanen iPSC-Kultur und der In-vitro-Differenzierung entlang mehrerer Zelllinien aufrechterhalten. Hier beschreiben wir unser AAVS1-Targeting-Protokoll, das standardisierte Spendervektoren und Konstruktionsmethoden verwendet, sowie praktische Überlegungen zur iPSC-Kultur, Arzneimittelauswahl und Genotypisierung.