Fettsäureprofile und ihre Verteilungsmuster in Mikroalgen: eine umfassende Analyse von mehr als 2000 Stämmen aus der SAG-Kultursammlung

Eine Datenbank mit FA-Profilen verschiedener Mikroalgen

Die Charakterisierung der FA-Profile der SAG-Mikroalgenstämme wurde durch Screening langkettiger FAs (C-14 – C-24), die in Lipiden verestert sind, durchgeführt. Insgesamt wurden 2076 Kulturstämme aus der SAG (das entspricht 91 % des SAG-Bestands) gescreent. Es wurde eine Datenbank erstellt, die alle identifizierten FAs und einige andere hydrophobe Metaboliten enthält. Tabelle 1 gibt einen Überblick über alle in den untersuchten Algenstämmen identifizierten Substanzen. Insgesamt wurden 86 verschiedene Substanzen durch Massenspektrometrie identifiziert, von denen 76 Methylester von FAs darstellen. Von den 76 Fettsäuren wurden 36 Substanzen anhand ihres Massenspektrums und der Retentionszeit entsprechend einer Standardsubstanz identifiziert, die anderen 40 Fettsäuren wurden nur anhand ihres Massenspektrums identifiziert. Die restlichen 10 Substanzen wurden ebenfalls nur anhand ihres Massenspektrums identifiziert. Bei Vergleichen mit einer Standardsubstanz wurde die Verbindung durch Vergleich mit den Massenspektren identifiziert, die der vorgeschlagenen Substanz in der MS-Bibliothek am ähnlichsten sind (Nist02 oder Wiley98). Auf diese Weise wurden einige Methylester von verzweigten FAs nachgewiesen, z. B. 12-Methyl-14:0 oder 3, 7, 11, 15-Tetramethyl-16:0. Während für die meisten FAMEs authentische Standards oder MS-Referenzen zur Verfügung standen, war für einige andere Substanzen nur eine „best hit“-Identifizierung möglich. Die DMOX-Derivate ermöglichten die Identifizierung der übrigen 12 FAMEs. Die nicht identifizierten Stoffe müssen noch mit authentischen Standards verifiziert werden, die zu diesem Zeitpunkt nicht verfügbar sind. Die vollständige Datenbank ist in Zusatzdatei 1 enthalten.

Bakterien in Algenkulturen (als Kontaminationen oder manchmal sogar durch Symbiose) sind gut bekannt und können in Kulturstämmen fast jeder Algenkultursammlung gefunden werden. Nur ein kleiner Teil (etwa 20 %) der untersuchten SAG-Stämme befindet sich im axenischen Zustand. Daher könnte auch der FA-Gehalt der kontaminierenden Bakterien zu dem erhaltenen FA-Profil beigetragen haben. Um dies zu prüfen, haben wir Methyl-15:0 und Methyl-17:0 gemessen, die als Marker für bakterielle Kontaminationen gelten. Nur 34 der 2076 untersuchten Stämme enthielten geringe Mengen Methyl-15:0. Dieser geringe Anteil an kontaminierenden Bakterien wurde durch mikroskopische Kontrollen bestätigt, die bei der kontinuierlichen Pflege von Algenstämmen Routine sind (Daten nicht gezeigt). Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass nur 1-2% der Stämme kontaminiert sein könnten und dass es nur einen geringen Einfluss bakterieller Kontaminationen auf die beobachteten FA-Profile der Algenkulturen gibt.

Zusätzlich verglichen wir die gemessenen Haupt-FA-Profile von 10 zufällig ausgewählten Stämmen aus verschiedenen Klassen mit veröffentlichten Daten (Tabelle 2), wobei zu beachten ist, dass nur einer der 10 Stämme, die aus den veröffentlichten Daten ausgewählt wurden, aus der SAG-Sammlung stammt. Bei 6 Stämmen waren die FA-Profile sehr ähnlich. Bei den 4 verbleibenden Stämmen wurden große Unterschiede im Grad der Entsättigung der FAs mit unterschiedlichen Kettenlängen festgestellt, was durch die unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen in den verschiedenen Studien erklärt werden kann.

Muster der Fettsäurezusammensetzung

Die FAME-Profile waren von Stamm zu Stamm recht unterschiedlich. In Abbildung 1 sind beispielsweise die FAME-Profile von vier verschiedenen Gattungen dargestellt, nämlich von Chroococcus (Cyanobakterien), Closteriopsis (Chlorophyta, Trebouxiophyceae), Pseudochantransia (Rhodophyta) und Prymnesium (Chromalveolaten, Haptophyta). Daher wurde erwartet, dass bestimmte unterschiedliche FA-Verteilungsmuster zwischen Phyla, Klassen und Gattungen von Mikroalgen gefunden werden. Darüber hinaus wurde geprüft, ob Unterschiede in den FA-Mustern auch für Gruppen mit niedrigerem taxonomischen Rang gefunden werden können, d.h. zwischen Arten derselben Gattung oder sogar zwischen mehreren Isolaten derselben Art.

2.1 Verteilung von vier wichtigen PUFAs unter den Stämmen der SAG-Algenkultursammlung

Die Verteilungsmuster der FAs unter und innerhalb der 17 Gruppen (Phyla oder Klassen) der Mikroalgen und der Cyanobakterien, die die untersuchten Stämme umfassen, wurden für vier PUFAs, die von hohem ernährungsphysiologischen Interesse sind, genauer untersucht (Tabelle 3). Die Häufigkeit des Vorkommens dieser vier PUFAs in einer bestimmten Gruppe von Mikroalgen ist als Prozentsatz der Stämme mit einem bestimmten FA von allen untersuchten Stämmen in Tabelle 3 angegeben.

Da sich die SAG-Kultursammlung auf mikroskopische Algen aus terrestrischen Lebensräumen konzentriert, waren die Haptophyta, Dinophyta und Phaeophyceae nur schwach vertreten. Daher sind die gefundenen Verteilungsmuster in diesen und anderen schlecht vertretenen Gruppen möglicherweise nicht repräsentativ für die gesamte Gruppe. So waren für die Phaeophyceae hauptsächlich mikroskopische Formen (z. B. Ectocarpus und die Süßwasser-Gattung Bodanella) verfügbar, und die untersuchten Rhodophyta-Stämme umfassten hauptsächlich Süßwasserformen oder solche aus terrestrischen Lebensräumen (z. B. Porphyridium). Obwohl Kieselalgen in terrestrischen Lebensräumen sehr vielfältig sind, repräsentiert die untersuchte kleine Stichprobe verfügbarer Kieselalgenstämme (18) diese Gruppe, die wahrscheinlich die artenreichste Algengruppe ist, bei weitem nicht adäquat. Auch für die beiden Klassen der Stramenopiles (Heterokont-Algen), Phaeothamniophyceae und Raphidophyceae, werden in der SAG jeweils nur zwei Stämme gehalten, die daher hier nicht weiter behandelt werden. Ebenso gibt es nur einen einzigen Stamm der Chlorarachniophyta (Übergruppe Rhizaria) in der SAG.

Die sehr langkettige PUFA Docosahexaensäure (DHA, 22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) war die dritthäufigste FA, die in 15 von 20 untersuchten Gruppen vorhanden war (Tabelle 3). In den Dinophyta, Haptophyta und Euglenoiden waren DHA-haltige Stämme besonders häufig, und DHA wurde dort in relativ hohen Prozentsätzen des Gesamt-FA-Gehalts gefunden, d. h. in 60 % oder mehr dieser Stämme war der DHA-Anteil höher als 5 %. In dem einzigen untersuchten Dinophytenstamm von Ceratium horridum lag der DHA-Anteil sogar bei 29,3 %. In den anderen Gruppen wurde DHA in eher geringen Häufigkeiten und auch meist in eher geringen Anteilen gefunden, d.h. weniger als 1% des gesamten FA-Gehalts. Obwohl DHA in den Cryptophyta und Bacillariophyceae in etwa jedem fünften Stamm gefunden wurde, betrug sein Anteil am Gesamt-FA-Gehalt dort weniger als 5 %, außer bei Cryptomonas baltica SAG 18.80 (Cryptophyta), wo er 13,7 % betrug. Obwohl DHA in den Grünalgen (Chlorophyta) in eher geringen Häufigkeiten gefunden wurde, wurde der zweithöchste DHA-Gehalt aller SAG-Stämme, 18,9% des Gesamt-FA, in dem Chlorophyten Chlorococcum novae-angliae SAG 5.85 gefunden, gefolgt von dem Trebouxiophyten Prototheca zopfii SAG 263-8 mit 14,2%. Insgesamt stimmen diese Ergebnisse mit den zuvor für bestimmte Algengruppen beschriebenen DHA-Mengen überein.

Eicosapentaensäure (EPA, 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)) war eine der häufigsten PUFAs und wurde in allen 17 Gruppen unserer Studie gefunden (Tabelle 3). EPA-haltige Stämme waren besonders häufig in den Eustigmatophyceae, Glaucophyta, Xanthophyceae und Rhodophyta. Die höchsten EPA-Anteile am Gesamt-FA-Gehalt fanden sich in den Rhodophyta, wo etwa 81 % der Stämme mehr als 10 % EPA aufwiesen. Die höchsten Werte waren 52,4 % in Compsopogonopsis leptoclados SAG 106.79 und 44,9 % in Acrochaetium virgatulum SAG 1.81. Auch Stämme von drei Porphyridium-Arten enthielten hohe Mengen an EPA (31,2 % in P. sordidum SAG O 500, 27,5 % in P. aerugineum SAG 110.79, 26,7 % in P. purpureum SAG 1380-1a). Dies stimmt mit einem Bericht über P. cruentum überein, der darauf hindeutet, dass Rotalgen eine reiche Quelle für EPA sind. Obwohl EPA in den Glaucophyta relativ häufig gefunden wurde, wies nur etwa die Hälfte aller Stämme EPA-Anteile von mehr als 10 % auf (maximal 31,1 % in Glaucocystis nostochinearum SAG 28.80). Dies stimmt mit einer anderen Studie überein, die hohe EPA-Anteile (neben ARA) im Glaukophyten Cyanophora paradoxa ergab. Der höchste Prozentsatz (87 %) von Stämmen mit einem EPA-Anteil von mehr als 10 % befand sich in den Dinophyta, mit einem Maximum von nur 24,3 % in Pyrocystis lunula SAG 2014. In den Euglenoiden, Xanthophyceae und Eustigmatophyceae wiesen etwa 67 % aller Stämme einen EPA-Anteil von mehr als 10 % auf, mit Höchstwerten von etwa 31 % (31,4 % in Heterococcus fuornensis SAG 835-5, 31,6 % in Euglena proxima SAG 1224-11a) und 34,6 % in Goniochloris sculpta SAG 29.96. EPA wurde selten und meist in unbedeutenden Mengen (< 5%) in den meisten Grünalgen gefunden, aber drei Stämme hatten einen außergewöhnlich hohen Gehalt von etwa 20% der gesamten FAs (24,2%, Chlorella sp. SAG 242.80; 24,0%, Chlamydomonas allensworthii SAG 28.98; 22,3%, Cylindrocapsa involuta SAG 314-1). EPA war der einzige FA, der in Chlorarachnion repens SAG 26.97 (Chlorarachniophyta) gefunden wurde. Die Tatsache, dass Xanthophyceae und Eustigmatophyceae EPA in relativ hohen Anteilen enthalten, während Grünalgen nur selten EPA akkumulieren, bestätigt frühere Studien.

Arachidonsäure (ARA, 20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) wurde am häufigsten bei den Phaeophyceae gefunden, wo sie in allen Stämmen mit Ausnahme eines untersuchten Stammes vorhanden war (Tabelle 3); in etwa 54 % aller Phaeophyceae-Stämme lag der Anteil an ARA über 10 %, jedoch mit einem Maximum von nur 17,7 % in Halopteris filicina SAG 10.96. Den höchsten Anteil an Gesamt-FA hatte ARA in den Rhodophyta; dort hatten sogar etwa 77% aller Stämme einen ARA-Gehalt von mehr als 10% mit einem Maximum von 68,3% in Pseudochantransia sp. SAG 19.96. Interessanterweise war der ARA-Gehalt bei den acht untersuchten Mehrfachisolaten des Rhodophyten Porphyridium purpureum recht hoch, aber variabel. Während der durchschnittliche ARA-Anteil bei sechs Stämmen bei etwa 31 % lag, betrug er bei SAG 1380-1d nur 3,8 %, bei SAG 1380-1e jedoch 44,5 %. Wir haben noch keine Erklärung für diese Abweichung; beide Stämme wurden aus marinen Lebensräumen isoliert und werden unter den gleichen Kulturbedingungen gehalten. Hohe Anteile von ARA (wie auch von EPA) wurden bereits bei einer anderen Porphyridium cruentum-Art festgestellt. ARA war in etwa der Hälfte aller untersuchten Euglenoid-Stämme vorhanden, und zwar mit relativ hohen Anteilen am Gesamt-FA-Gehalt, d. h. etwa ein Drittel der Stämme wies mehr als 5 % ARA auf, mit außergewöhnlich hohen Werten von 41,3 % und 34,3 % bei Rhabdomonas incurva SAG 1271-8 und Khawkinea quartana SAG 1204-9. Interessanterweise wies ein anderer Stamm derselben Art, K. quartana SAG 1204-9, weniger als die Hälfte (13,3 %) des ARA-Gehalts auf, und in fünf anderen Rhabdomonas-Arten wurde kein ARA nachgewiesen. Dies zeigt, dass der FA-Gehalt zwischen Arten derselben Gattung und sogar zwischen mehreren Isolaten derselben Art recht unterschiedlich sein kann. Obwohl etwa die Hälfte aller untersuchten Stämme der Xanthophyceae und Eustigmatophyceae ARA enthielten (Tabelle 3), wiesen sie diesen FA in relativ geringen Anteilen auf. Nur ein Viertel der ARA-haltigen Xanthophyceae-Stämme wies mehr als 5 % auf und bei den Eustigmatophyceae erreichte sogar kein Stamm 5 %. Bei den Grünalgen wurde ARA nur selten gefunden, d. h. mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von etwa 14 % in den Phyla Chlorophyta und Streptophyta, mit Ausnahme der prasinophytischen Grünalgen, wo ARA in 42,9 % aller Stämme vorhanden war (Tabelle 3). Es gab jedoch einige einzelne Grünalgen mit außergewöhnlich hohen ARA-Gehalten, nämlich 73,8 % (entsprechend 102 μg/mg Trockengewicht, dem höchsten in allen untersuchten SAG-Stämmen nachgewiesenen ARA-Gehalt) im Chlorophyten Palmodictyon varium SAG 3.92, gefolgt von 52,9 % im Chlorophyten Trochisciopsis tetraspora SAG 19.95 und 51,8 % im Trebouxiophyten Myrmecia bisecta SAG 2043. Der hohe ARA-Gehalt des letztgenannten Stammes stimmt damit überein, dass er ein naher Verwandter von Parietochloris incisa (syn. Lobosphaeropsis incisa, Myrmecia incisa) geworden ist. P. incisa wird als „ölhaltige Mikroalge“ und als die reichste bisher bekannte pflanzliche ARA-Quelle bezeichnet, da sie in der Lage ist, große Mengen an ARA zu akkumulieren (bis zu 59 % ihres gesamten FA-Gehalts). Interessanterweise wies der SAG-Stamm von P. incisa (Lobosphaera incisa SAG 2007) mit 13,2 % einen viel geringeren ARA-Gehalt auf (Tabelle 2).

γ-Linolensäure (GLA, 18:3(6Z, 9Z, 12Z)) war der dritthäufigste FA in der untersuchten Probe von SAG-Mikroalgenstämmen, der nur in den Haptophyta, Dinophyta und Euglenoiden fehlte (Tabelle 3). Sie wurde am häufigsten in zwei Grünalgenlinien, den Prasinophyten und den Streptophyten, nachgewiesen. Bei den Prasinophyten war GLA jedoch nur in einer der fünf für diese Gruppe verfügbaren Gattungen, Tetraselmis, vorhanden, und zwar in 12 der 17 verfügbaren Stämme und mit unterschiedlichen Anteilen, d. h. 0,5 – 7,3 % des gesamten FA-Gehalts. In den Streptophyta war GLA weiter verbreitet, d. h. es wurde in 17 von 41 untersuchten Gattungen nachgewiesen. Die Verteilung von GLA war innerhalb der Stämme und Arten einer bestimmten Streptophytengattung recht variabel, ähnlich wie die Ergebnisse für ARA in anderen Gattungen. Relativ hohe Prozentsätze von GLA wurden in Arten/Stämmen von Closterium gefunden (16,5% in C. baillyanum SAG 50.89, 8% in C. lunula SAG 7.84), aber GLA wurde in den anderen 12 Stämmen dieser Gattung nicht gefunden. In ähnlicher Weise wurde GLA in den vielen Stämmen, die für Cosmarium (25) und Micrasterias (16) verfügbar waren, nur in 11 bzw. 2 Stämmen gefunden. Die höchsten Anteile an GLA wurden in der Grünalgenklasse Chlorophyceae (29,9 % in Deasonia multinucleata SAG 25.95, 28,5 % in Desmodesmus multiformis SAG 26.91) und in Cyanobakterien (24,8 % in Spirulina maxima SAG 84.79) gefunden. In etwa einem Drittel (32 %) aller Chlorophyten-GLA-Stämme wies dieser FA Prozentsätze von 5 % und mehr auf. Die Verteilung von GLA in den Cyanobakterien war eher lückenhaft, d.h. die 27 Cyanobakterien-Stämme mit GLA waren hauptsächlich auf drei Gattungen beschränkt, Calothrix (8 Stämme), Microcystis (7 Stämme) und Spirulina (6 Stämme). Auch innerhalb jeder dieser Gattungen waren die GLA-Prozentsätze recht unterschiedlich, z. B. schwankte er bei Spirulina zwischen 4,6 % und 24,8 %, und drei Stämme waren ohne GLA. Die FA-Zusammensetzung wurde bereits früher zur Unterscheidung von Cyanobakterien in Isolaten und natürlichen Proben auf Gattungsebene verwendet. Zur Unterscheidung von Cyanobakterienarten wurde in einer früheren Studie die Kohlenwasserstoffzusammensetzung als zusätzlicher Marker verwendet, aber in unserer Studie konnten wir keine Substanz aus dieser Gruppe nachweisen. Interessanterweise war GLA der einzige FA, der in mehr als drei der 223 untersuchten Stämme nachgewiesen wurde. Daher können die SAG-Cyanobakterienstämme grob in solche mit GLA (wenige Gattungen) und solche, in denen fast keine PUFAs vorhanden waren, unterteilt werden. Dies entspricht früheren Erkenntnissen, die eine Zweiteilung der Cyanobakterien unabhängig von ihrer taxonomischen Stellung in Gattungen, die C-18-PUFA produzieren, und solche, die dies nicht tun, beschrieben.

Die Prasinophyten-Gattung Tetraselmis stellt ein interessantes Beispiel dar, um auf FA-Variationen zwischen eng verwandten Isolaten zu testen. Neun Stämme, die dieser Gattung zugeordnet werden, wurden von derselben (marinen) Lokalität isoliert und vom Isolator als dieselbe Art betrachtet (U.G. Schlösser, pers. Mitt.). Nur in zwei Stämmen war DHA vorhanden, allerdings in sehr geringen Spuren (0,3% und 0,4%). Im Gegensatz dazu wurden ARA und GLA in allen Isolaten gefunden, wobei die Prozentsätze von 0,8 % bis 2,7 % bzw. 0,5 % bis 7,3 % variierten.

2.2 Analyse der FA-Verteilungsmuster

Die nachgewiesene Fettsäurezusammensetzung (FA) der 2076 untersuchten Stämme wurde statistisch analysiert, um zu prüfen, ob bestimmte Muster der FA-Verteilung unter den verschiedenen untersuchten Algengruppen vorhanden sind, die ihren phylogenetischen Beziehungen entsprechen könnten. In einem ersten Satz von drei Analysen (höhere taxonomische Ebenen) wurde getestet, 1) ob die FA-Verteilungsmuster Unterschiede zwischen den Algenphyla widerspiegeln, die aus primärer (Übergruppe Plantae) oder sekundärer Endocytobiose (Chromalveolaten, Euglenoide) im Vergleich zu den Cyanobakterien, die den plastiden Ursprung repräsentieren, 2) die Unterscheidung der Phyla innerhalb der Übergruppe der Plantae (Chlorophyta, Streptophyta, Rhodophyta/Glaucophyta) und 3) die wichtigsten evolutionären Linien (Klassen) innerhalb der Chlorophyta. Eine zweite Reihe von Analysen konzentrierte sich auf die Gattungsebene, d. h. es wurde geprüft, ob sich die Trennung der Gattungen, wie sie auf der Grundlage früherer 18S rDNA-Sequenzanalysen für Chlamydomonas s.l., Chlorella s.l. und Scenedesmus s.l. vorgeschlagen wurde, in den FA-Verteilungsmustern widerspiegelt. Für die erste Reihe von Analysen mussten die vielen Arten (266), die als Mehrfachstämme vertreten waren (z. B. Chlamydomonas moewusii, 28), auf nur einen einzigen Stamm pro Art reduziert werden, um Verzerrungen zu vermeiden. Dazu gehörten auch die Mehrfachstämme, die nicht auf Artniveau identifiziert wurden, d. h. mit „sp.“ anstelle eines Artnamens gekennzeichnet waren (z. B. Chlorogonium sp., 26). Die Chlorophyta-Stämme der SAG waren besonders reich an solchen Mehrfachstämmen. Außerdem wurden diejenigen Stämme ausgeschlossen, bei denen nur ein einziger FA nachgewiesen wurde. Dadurch reduzierte sich die Gesamtzahl der in unseren Berechnungen berücksichtigten Stämme auf 1193. Die Stämme wurden dann in elf Gruppen eingeteilt, die ungefähr den Phyla oder Klassen entsprechen (Additional file 2). Stämme, die zu den Chlorophyta gehören (61 % aller untersuchten Stämme), wurden weiter in die drei Klassen Chlorophyceae, Trebouxiophyceae und Ulvophyceae unterteilt, während die prasinophytischen SAG-Grünalgenstämme (1,7 % aller betrachteten Chlorophyta-Stämme) von den Analysen ausgeschlossen wurden, da sie nur sehr wenige Arten umfassten (10). Die Stämme der Glaucophyta (15) und Rhodophyta (81) wurden gemeinsam als eine zusammengesetzte Einheit behandelt. Die Rhizaria – Chlorarachniophyta – war nur durch einen einzigen Stamm vertreten und wurde daher von den statistischen Analysen ausgenommen.

Analysen auf höherer taxonomischer Ebene

Es wurde geprüft, ob die Verteilungsmuster der FA-Zusammensetzung der untersuchten Stämme die drei „Supergruppen“ der eukaryotischen Algen, Plantae, Chromalveolate und Excavate (Euglenoide), und die Cyanobakterien voneinander abgrenzen. Die Supergruppe der Plantae umfasst ausschließlich Eukaryoten mit Plastiden, die durch primäre Endozytobiose entstanden sind, d. h. ein Cyanobakterium wurde durch Aufnahme und Speicherung durch die Wirtszelle in eine Organelle umgewandelt, wobei ein Großteil des Genoms verloren ging. Chromalveolat-Algen sowie die Euglenoiden (die einzige Algenlinie der Excavaten) erwarben ihre Plastiden durch sekundäre Endozytobiose von Rhodophyten bzw. einer Grünalge. Um eine annähernd gleiche Anzahl von Stämmen für alle vier Gruppen zu berücksichtigen, wurden 100 Stämme von Plantae, Chromalveolaten und Cyanobakterien nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, was in etwa der Gesamtzahl der betrachteten Euglenoiden-Stämme entspricht (73). Die Ordination, die sich aus der CVA (Canonical Variates Analysis, Multigruppen-Diskriminanzanalyse) ergab, zeigte einen starken Unterschied zwischen Cyanobakterien/primärer Endozytobiose (Plantae) und den beiden Gruppen, die die sekundäre Endozytobiose repräsentieren (Chromalveolaten/Euglenoide) (Abbildung 2). Der beobachtete Unterschied wurde ausnahmslos durch nichtparametrische Signifikanztests für mehrdimensionale Daten (NP-MANOVA und ANOSIM) bestätigt. Nach SIMPER war die geringste beobachtete Unähnlichkeit (63,55 %) zwischen Cyanobakterien und Plantae, während die höchste (77,29 %) zwischen Plantae und Chromalveolaten zu verzeichnen war. Die erste kanonische Varietät (CV1) umfasste 99,99 % aller möglichen Unterschiede zwischen den vier Gruppen, weshalb wir nach möglichen Korrelationen zwischen dieser Achse und den FAs suchten. Vier FAs waren signifikant und ausschließlich mit der ersten kanonischen Varietät (CV1) korreliert, d.h. 16:0 (ρCV1 = -0,61/p < 0.001), 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0.46/p < 0.001), 9-Octadecanamid (ρCV1 = 0.41/p < 0.001), und 18:1(9Z) (ρCV1 = -0.17/p = 0.001). In einer zweiten Analyse wurde geprüft, ob die FA-Verteilungsmuster Phyla der Supergruppe Plantae, d. h. die beiden Linien der Grünalgen, Chlorophyta und Streptophyta , und die zusammengesetzte Gruppe Rhodophyta/Glaucophyta unterscheiden. Da letztere mit 54 Stämmen die kleinste Gruppe war, wurde sie mit jeweils gleich großen Stichproben aus den Chlorophyta und Streptophyta verglichen (Tabelle 3). Das Ordnungsdiagramm aus einer CVA der insgesamt 162 untersuchten Stämme trennte die Gruppe Rhodophyta/Glaucophyta deutlich von den beiden Grünalgenphyla (Abbildung 3). CV1 betraf 79% aller möglichen Unterschiede und auch CV2 war mit 21% nicht zu vernachlässigen. Die Signifikanztests, NP-MANOVA und ANOSIM, bestätigten die Unterscheidung aller drei Gruppen. SIMPER zeigte, dass die zusammengesetzte Gruppe Rhodophyta/Glaucophyta ziemlich unähnlich zu den beiden Grünalgenphyla war, d. h. es gab Unähnlichkeiten von 70,55 % und 71,53 % mit den Chlorophyta bzw. Streptophyta. Die geringste Unähnlichkeit (55,41 %) unter den drei untersuchten Gruppen bestand zwischen Chlorophyta und Streptophyta. Es gab fünf FAs, die signifikant und ausschließlich mit CV1 korrelierten, nämlich 18:3(9Z, 12Z, 15Z) (ρCV1 = 0,77/p < 0,001), 20:4 (ρCV1 = -0.49/p < 0.001), 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) (ρCV1 = -0.59/p < 0.001), 18:1(9Z) (ρCV1 = 0.30/p = 0.001) und 16:0 (ρCV1 = -0.56/p = 0, 001). Zwei FAs waren ausschließlich mit CV2 korreliert, d. h. sie unterschieden Chlorophyta und Streptophyta: 18:1(9Z) (ρCV2 = -0,4477/p < 0,001) und 9-Octadecanamid (ρCV2 = 0,34/p < 0,001). Der bei weitem größte Anteil aller betrachteten Stämme (60,3 %) gehörte zu den Chlorophyta, was es interessant machte, zu prüfen, ob die FA-Verteilungsmuster zwischen den drei Klassen der Chlorophyta, den Chlorophyceae, Trebouxiophyceae und Ulvophyceae, unterscheiden können. Ulvophyceae war mit nur 49 Stämmen die kleinste der drei Klassen, daher wurden für die statistischen Analysen Stichproben von fast gleicher Größe (54) aus jeder der beiden anderen Klassen verwendet. Die CVA ergab keine eindeutigen Gruppen, d. h. die analysierten Stämme bildeten tendenziell drei Gruppen, die den drei Grünalgenklassen entsprachen, wobei es jedoch zu erheblichen Überschneidungen zwischen ihnen kam (Abbildung 4). Die drei Klassen unterschieden sich jedoch sowohl bei den angewandten Signifikanztests als auch bei SIMPER signifikant voneinander. Letztere und Korrelationsanalysen erlaubten es, 9-Octadecanamid (ρCV1 = -0.58/p < 0.001; ρCV2 = -0.22/p < 0.010) und den FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0.44/p < 0.001; ρCV2 = -0,53/p < 0,001) als die einzigen Variablen, die Ulvophyceae gut von Chlorophyceae/Trebouxiophyceae bzw. Trebouxiophyceae von Ulvophyceae/Chlorophyceae unterscheiden.

Analysen auf Gattungsebene

Die drei vorangegangenen Analysen haben gezeigt, dass sich phylogenetische Beziehungen auf der Ebene der Phyla und der Klassen unter den Algengruppen in den FA-Verteilungsmustern widerspiegeln, wobei eine große Stichprobe von Stämmen verwendet wurde. Daher haben wir in einer zweiten Gruppe von Analysen getestet, ob Unterschiede in den FA-Verteilungsmustern die gleiche Unterscheidung von Gattungen auflösen können wie in den rRNA-Gen-Sequenzanalysen. Um dies zu testen, wählten wir drei Gattungen aus, die in biotechnologischen Anwendungen weit verbreitet und durch SAG-Stämme gut vertreten sind, d. h. Chlorella s.l., Scenedesmus s.l. und Chlamydomonas s.l.. Kürzlich durchgeführte18S rRNA-Gen-Sequenzanalysen haben gezeigt, dass alle drei Arten para- oder polyphyletische Gruppen sind, die mehrere verschiedene Gattungen umfassen. Für Chlamydomonas haben wir 17 Arten (53 Stämme) ausgewählt, von denen 9 durch mehrere Stämme vertreten waren (z. B. C. reinhardtii, 16), die in der 18S rDNA-Phylogenie auf fünf unabhängige Linien/Kladen (= Gattungen) verteilt waren. Zur besseren Repräsentation der „Oogamochlamys“-Klasse wurden auch zwei Stämme aus der UTEX-Sammlung (2213, 1753) einbezogen. Die NMDS-Ordnung trennte die Mitglieder der „Reinhardtii“-Klade (oben rechts in Abbildung 5), mit Ausnahme von drei Stämmen, deutlich von denen der „Chloromonas“-Klade (unten links in Abbildung 5). Die „Chloromonas“-Gruppe, wie sie sich aus den FA-Mustern ergab, umfasste jedoch auch die drei untersuchten Stämme der „Moewusii“- und vier der „Oogamochlamys“-Klade, was im Gegensatz zu den 18S-rDNA-Phylogenien von steht. Ebenfalls im Gegensatz zu den rDNA-Phylogenien spalteten die FA-Analysen die Gattung Lobochlamys auf, d. h. L. culleus war Teil der „Chloromonas“-Gruppe, während L. segnis zur „Reinhardtii“-Gruppe gehörte. Stämme von Oogamochlamys wurden ebenfalls auf beide FA-Gruppen aufgeteilt, im Gegensatz zu ihren Artzuordnungen, die auf den 18S rDNA-Analysen basieren.

Spezies und Stämme, die früher einer einzigen Gattung Scenedesmus zugeordnet wurden, erwiesen sich durch rRNA-Gen-Sequenzanalysen als tatsächlich auf mehrere Gattungen verteilt. So wurde beispielsweise die Gattung Acutodesmus von Scenedesmus abgespalten. Eine NMDS-Ordnungsgrafik der FA-Verteilungsmuster zeigte eine Tendenz zur Verteilung der untersuchten Stämme auf zwei Cluster, d. h. ein Cluster mit 8 Stämmen von Acutodesmus (hauptsächlich einschließlich mehrerer Stämme von A. obliquus) war deutlich von einem anderen Cluster getrennt, der hauptsächlich Stämme von Scenedesmus s.str. enthielt. (Abbildung 6). Die Mehrfachstämme von S. vacuolatus wurden mit vier anderen Stämmen der Gattung gruppiert, mit Ausnahme von SAG 211-11n, das sich in der Nähe des Acutodesmus-Clusters befand. Die Mehrfachstämme von A. obliquus hingegen waren auf beide Cluster verteilt (Abbildung 6). Sieben Stämme von A. obliquus bildeten hauptsächlich den Acutodesmus-Cluster, während fünf andere A. obliquus-Stämme zusammen mit Stämmen von Scenedesmus s.str. gruppiert waren. Das bedeutet, dass es innerhalb derselben Grünalgenart, A. obliquus, zwei unterschiedliche FA-Muster gibt. AFLP-Fingerabdrücke zeigten bereits eine umfangreiche genetische Variation zwischen den verschiedenen Stämmen von A. obliquus, während ITS2 rDNA-Sequenzvergleiche die Konspezifität der verschiedenen Stämme, mit Ausnahme von SAG 276-20, belegten (T. Friedl, unveröffentlichte Beobachtung). Die Feststellung, dass die A. obliquus-Stämme in zwei FA-Mustergruppen aufgeteilt sind, spricht daher dafür, dass die durch AFLPs festgestellten genetischen Unterschiede möglicherweise mit unterschiedlichen phänotypischen Eigenschaften korrespondieren. Folglich kann es von entscheidender Bedeutung sein, sorgfältig zu dokumentieren, welcher Stamm für eine bestimmte Anwendung verwendet wurde. Obwohl sich herausstellte, dass der Stamm SAG 276-20 nicht zu derselben Art, nämlich A. obliquus, gehört, deutet sein FA-Muster darauf hin, dass er dennoch ein Mitglied von Acutodesmus sein könnte, da er in den Acutodesmus-Cluster eingeordnet wurde (Abbildung 6).

Chlorella vulgaris ist ein weiteres Beispiel, bei dem durch AFLP-Analysen eine umfangreiche genetische Variation zwischen mehreren Stämmen der gleichen Art festgestellt wurde. Die 15 multiplen SAG-Stämme von C. vulgaris wurden mit 19 anderen Chlorella- und Chlorella-ähnlichen Stämmen verglichen, d. h. mit ihren engsten Verwandten aus der 18S rDNA-Phylogenie, C. sorokiniana und C. lobophora, Mitgliedern der Parachlorella-Klade sensu sowie mit weiter entfernten Stämmen, z. B. aus den Watanabea- und Prasiola-Kladen sensu. Die NMDS-Ordnung auf der Grundlage des FA-Verteilungsmusters zeigte fast keine Variation innerhalb der verschiedenen Stämme von C. vulgaris und fasste sie mit Ausnahme des Stammes SAG 211-1e zusammen (Abbildung 7). Ein weiterer, von C. vulgaris entfernter Cluster wurde von Mitgliedern der Watanabea-Gruppe gebildet, während Chlorella-ähnliche Algen der Prasiola-Gruppe nicht zusammen geclustert wurden.