Proteinexpression, Reinigung und Testverfahren von hAASS-SDH
Vektor: pFB-LIC-Bse
Zelllinie: DH10Bac
Tags und Zusätze: N-terminaler, durch TEV-Protease spaltbarer Hexahistidin-Tag
Proteinsequenz konstruieren:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(unterstrichene Sequenz enthält vektorkodierten His-Tag und TEV-Proteaseschnittstelle*)
Geerntete Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL pro 1 mL Proteaseinhibitorcocktail EDTA-frei) resuspendiert.
Das Zellpellet wurde in ca. 200 mL Lysepuffer gelöst und durch Homogenisierung in 2 Durchgängen bei 12.000 psi gebrochen. Die Zelltrümmer wurden bei 35000 x g, 1 Stunde pelletiert, und der Überstand wurde für die Reinigung auf einer Schwerkraftfluss-Ni-NTA-Säule (5 ml) verwendet.
Die verwendeten Puffer sind im Folgenden aufgeführt;
Bindungspuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Waschpuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 40 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Elutionspuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 250 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Der geklärte Zellextrakt wurde zu 5 ml mit Lysispuffer voräquilibriertem Ni-NTA-Harz gegeben und durch eine Glassäule geleitet. Die Säule wurde dann mit Bindungspuffer (2 x 50 mL) und Waschpuffer (2 x 50 mL) gewaschen. Das Protein wurde mit Elutionspuffer in 5 x 5 mL Fraktionen eluiert. Die eluierten Fraktionen von Säule 1 wurden gepoolt und mit einem 30 kDa MWCO Spin-Konzentrator auf 5 mL konzentriert und in eine S200 16/60-Säule (voräquilibriert in GF-Puffer (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% Glycerol)) bei 1,0 mL/min injiziert. Es wurden 1,5 mL-Fraktionen gesammelt. Das eluierte Protein wurde über Nacht bei 4 °C durch TEV-Protease (1/20 (w/w)) gespalten. Am nächsten Tag wurde die Proteinprobe auf eine 0,5-ml-Ni-Sepharose-Säule geladen, die mit GF-Puffer voräquilibriert war, um das nicht gespaltene Protein zu entfernen. Die gepoolten Proteinfraktionen wurden mit einem 30 kDa mwco Konzentrator auf 13 mg/mL konzentriert.
Aktivitätsassay und Screening
Die SDH-Aktivität von hAASS wurde gemessen, indem die Reduktion von NAD+ zu NADH verfolgt wurde, wobei der Vorteil genutzt wurde, dass die reduzierte Form von NADH bei Anregung mit 340 nm Licht fluoresziert. Wir haben den Assay im 384-Well-Format durchgeführt und die Detektion mit dem PheraStar-Fluoreszenz-Reader (BMG Labtech) durchgeführt (Anregung/Emission = 340/480 nm). Dieser Assay zeigte eine lineare Reaktion bei Proteinkonzentrationen bis zu 150 nM. Eine typische Reaktion besteht aus 100 nM gereinigtem Enzym, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM Saccharopin. Der Reaktionspuffer besteht aus 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS. Die Substanzbibliotheken (LOPAC (Sigma) und NIH Clinical Collections I&II) wurden intern bei einer Substanzkonzentration von 20 μM gescreent.
Differential Scanning Fluorimetry
DSF wurde in einer 96-Well-Platte unter Verwendung einer Mx3005p RT-PCR-Maschine (Stratagene) mit Anregungs- und Emissionsfiltern von 492 bzw. 610 nm durchgeführt. Jede Vertiefung enthielt 2 µL Protein in 2 µM DSF-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE, 1000-fach verdünnt in DSF-Puffer aus dem Bestand des Herstellers (Invitrogen), und (falls zutreffend) 2 µL Ligand in verschiedenen Konzentrationen. Die Fluoreszenzintensitäten wurden von 25 bis 96°C mit einer Rampenrate von 3°C/min gemessen.
Kristallisation
Apo-Kristalle wurden durch Mischen von 50 nL hAASS-SDH-Protein (80 mg/mL) mit 100 nL Reservoirlösung mit 20% PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 und 0,2-0,33 M Natriummalonat hergestellt. NAD+-gebundene Kristalle wurden durch Mischen von 100 nL hAASS-SDH (18 mg/mL, im molaren Überschuss von NAD+) mit 50 nL Reservoirlösung, die 25% PEG3350, 0,2M NaCl und 0,1M Tris pH 8,5 enthält, hergestellt. Die Kristalle wurden vor dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff in 9%igem Butandiol kryo-geschützt. Für die Fragment-Screening-Kampagne wurden die Kristalle mit Verbindungen (10/50/500 mM) in der mit 8% Butandiol ergänzten Kristallisationslösung für 5-30 min getränkt und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Strukturbestimmungsverfahren
hAASS-SDH apo und NAD+-gebundene Kristalle gehören zu unterschiedlichen Raumgruppen (P43212 vs P212121). Die Struktur von hAASS-SDH wurde durch molekulare Ersetzung mit dem Programm PHASER gelöst, wobei die pilzliche Saccharopin-Reduktase aus S. cerevisiae (PDB-Code 2AXQ) als Suchmodell verwendet wurde (38 % Sequenzidentität). Es wurden zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit (a.u.) gefunden. Das ursprüngliche Modell wurde mit phenix.autobuild neu aufgebaut. Ein gebundenes NAD+-Molekül im aktiven Zentrum wurde mit der Differenz-Fourier-Methode identifiziert und manuell mit Coot in die Elektronendichte eingefügt. Zur Vervollständigung des Modells wurden iterative Zyklen von phenix.refine einschließlich TLS-Verfeinerung durchgeführt, gefolgt von manueller Modellerstellung für fehlende Reste mit Coot. Aufgrund von Konformationsunterschieden in Domäne III (Res. 278-376) der beiden Kopien im a.u. wurden keine NCS-Restriktionen angewendet. Für die Fragment-Screening-Kampagne wurden die Liganden mit DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) anhand von Differenzdichtekarten identifiziert. Schwächere Bindemittel mit geringer Belegung wurden mit PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/) bewertet, das auf statistischen Modellen basiert, um die Ligandendichte in einem bestimmten Datensatz zu finden, die in der Mehrheit der Datensätze nicht vorhanden ist. Koordinaten und Strukturfaktoren für alle Datensätze sind in der RCSB Protein Data Bank hinterlegt. Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken sind auf den PDB-Seiten verfügbar.
Kommerziell erhältliche Reagenzien
CRISPR/Cas9-Knockout-Plasmide
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Kat. Nr. 10157