Während Proteintests in der biowissenschaftlichen Forschung eine Vielzahl von Anwendungen haben, gibt es keine einzige Testmethode, die für alle Anwendungen geeignet ist. Trotz aller Fortschritte in der modernen Wissenschaft gibt es keine Protein-Assay-Methode, die nicht durch Nicht-Protein-Komponenten oder Unterschiede in der Proteinzusammensetzung beeinflusst wird. Aus diesem Grund ist es für Proteinlaboratorien notwendig, mehr als eine Art von Proteintest für Forschungsanwendungen zu haben.
Jeder Test hat seine eigenen Vorteile und Grenzen. Wenn Sie also genaue Ergebnisse aus Ihrem Experiment erhalten möchten, sollten Sie in der Lage sein, den für Ihre Anwendung am besten geeigneten Assay auszuwählen.
Typen kolorimetrischer Proteintests
Basierend auf der involvierten Chemie sind die beiden gängigsten Methoden für den kolorimetrischen Nachweis und die Quantifizierung von Gesamtprotein der Protein-Farbstoffbindungs-Assay und/oder der Kupferionen-basierte Chelat-Assay.
Farbstoffbindungsassays
Farbstoffbindungsassays, wie der Bradford- (Coomassie) und der 660nm-Proteinassay, basieren auf der Bindung von Proteinmolekülen an den Coomassie-Farbstoff unter sauren Bedingungen. Sobald die Proteinmoleküle an den Farbstoff binden, wechselt die Farbe von braun (Amax= 465nm) zu blau (Amax= 610nm). Die Änderung der Farbdichte (die bei 595 nm abgelesen wird) ist proportional zur Proteinkonzentration.
Die basischen Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin) spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Farbstoff-Protein-Komplexen und der daraus resultierenden Spektralverschiebung, während kleinere Proteine (weniger als 3 kDa) und Aminosäuren keine Farbveränderungen hervorrufen.
Assays auf der Basis von Kupferionen
Bei Proteinassays auf der Basis von Kupferionen wird die Proteinlösung mit einer alkalischen Kupfersalzlösung gemischt, um die Chelatbildung von Kupferionen (Cu2+) mit den Peptidbindungen und die anschließende Reduktion der Kupferionen (Cu2+) zu Kupferionen (Cu+) zu erleichtern. Überschüssige Kupferionen bleiben ungebunden an den Peptidbindungen und stehen für den Nachweis zur Verfügung.
Proteinassays auf der Basis von Kupferionen können in zwei Gruppen unterteilt werden – (1) Assays, die reduzierte Kupfer(II)-Ionen (Cu+) nachweisen, und (2) Assays, die ungebundene Kupfer(II)-Ionen (Cu2+) nachweisen. Zum Nachweis von Kupfer(II)-Ionen können Bicinchoninsäure (BCA) oder Folin-Reagenz (Phosphomolybdän-/Phosphorwolframsäure) verwendet werden. Bei der Reduktion des verwendeten Reagenzes entsteht eine blaue Farbe. Die Menge der erzeugten Farbe kann bei 650nm bis 750nm abgelesen werden und ist proportional zur Menge der Peptidbindungen.
Hinweis: Das Vorhandensein von Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Histidin und Asparginin im Protein erhöht die resultierende Farbdichte.
Bei Tests, die auf dem Nachweis ungebundener Kupfer(II)-Ionen beruhen, wird alkalisches Kupfer mit der Proteinlösung gemischt und die ungebundenen Kupfer(II)-Ionen werden dann mit einem farbgebenden Reagenz, das mit Kupfer(II)-Ionen reagiert, nachgewiesen. Die Menge der erzeugten Farbe ist umgekehrt proportional zu der Menge der Peptidbindung in der Probe.
Auswahl von Protein-Assays: Einige zu berücksichtigende Faktoren
Es gibt eine Reihe von Faktoren, die Sie bei der Auswahl eines Assays berücksichtigen sollten. Hier sind einige von ihnen.
- Kompatibilität mit dem Probentyp und den Komponenten. Die Art der Proteinprobe und das Vorhandensein von Nicht-Proteinwirkstoffen in Proteinlösungen können die Ergebnisse Ihres Experiments erheblich beeinflussen. Denken Sie daran, dass das Vorhandensein von Reduktionsmitteln, Metallchelatbildnern, Farbstoffen, Aminen und Zuckern mit kupferbasierten Proteintests interferiert, während Proteinlösungen, die Detergenzien enthalten, mit farbstoffbasierten Proteintests interferieren.
- Assaybereich und erforderliches Probenvolumen. Die meisten kolorimetrischen Assays erfordern mindestens 0,5 µg Proteine für eine zuverlässige Schätzung. Bei schwer zu beschaffenden Proben sollten daher Methoden in Betracht gezogen werden, die die geringste Probenmenge für eine zuverlässige Schätzung erfordern.
- Einheitlichkeit von Protein zu Protein. Farbstoffbasierte Proteintests und solche, die die Reduktion von Kupfer(II)-Ionen zu Kupfer(II)-Ionen beinhalten, weisen erhebliche Protein-zu-Protein-Variationen auf.
- Zeitliche Aspekte. Die Komplexität der Probe und die gewählte Assay-Methode bestimmen die Zeit, die Sie für die Durchführung Ihres Protein-Assays benötigen. Proteinproben, die Störstoffe enthalten, und Assays, die Standardplots oder -kurven verwenden, benötigen mehr Zeit.
- Anforderungen an die Geräte. Die Verfügbarkeit eines Spektralphotometers oder eines Plattenlesegeräts, das zur Messung der durch den Assay erzeugten Farbe (Absorption) erforderlich ist, kann Ihre Wahl ebenfalls beeinflussen.
